Western blotting之樣品制備注意事項

無論你是處理細胞還是組織樣本，蛋白提取都是一個很艱難的過程。要么使用物理方法將細胞破碎或者使用化學試劑處理細胞進行裂解。如果第一步提取就搞砸的話，那么長時間小心翼翼培養(yǎng)的細胞就會完全浪費。這里有一些建議可以幫助你進行樣品的抽提。

頭號公敵：蛋白酶
無論您選擇哪種提取方法，蛋白酶都將是一個主要的關注點。當你需要的時候，蛋白酶是很有用的，但是如果你不需要，它們會在短時間內(nèi)降解目標蛋白。在細胞被胰蛋白酶消化后，在裂解前徹底清洗去除所有的胰蛋白酶。同樣的道理也適用于組織，在溶解前要徹底清洗，以清除殘留的血液，其中也含有蛋白酶。清洗之后細胞是干凈的，準備裂解，要添加蛋白酶抑制劑到裂解緩沖液中。使用蛋白酶抑制劑，并保持樣本在冰上，以防止蛋白降解。如果研究的是磷酸化蛋白，也可以添加磷酸酶抑制劑。
 
物理vs.化學方法破碎細胞
物理裂解方法包括超聲、均質(zhì)、反復凍融和機械破碎(研磨、切碎和碾壓)。當不想把化學和酶引入到提取系統(tǒng)中，物理裂解是理想的。然而，專業(yè)設備的要求往往會使過程不一致，難以擴大規(guī)模，成本過高。由于物理方法有關的壓力和溫度很高，因此還必須小心避免蛋白變性和聚集。在整個過程中，把所有的東西都預先冷卻，并保持樣品的低溫狀態(tài)。
如果您無法使用物理方法裂解細胞，請不要擔心。有很多抽提試劑可以幫助提取蛋白。試劑裂解法因其操作簡便、蛋白提取量高、穩(wěn)定性好、價格低廉等優(yōu)點而日益受到人們的歡迎。試劑裂解法的主要缺點是一些鹽和去垢劑等干擾下游分析。如果進行蛋白功能研究，在選擇緩沖液和去垢劑時需要謹慎。

Apexbio蛋白的抽提試劑

去垢劑的選擇
如果抽提的樣品量大，添加SDS和其他離子去垢劑到你的緩沖液將是你最好的選擇。對于Western blotting，使用含有SDS的緩沖液是理想的，例如1X RIPA，因為它在溶解細胞蛋白方面非常有效。如果蛋白需要在其天然構(gòu)象中正常發(fā)揮作用，最好使用溫和的提取方法，使用非離子去垢劑，如NP-40或Triton X-100。
濃度測定：最后，使用Bradford、BCA或Lowry進行蛋白的測定，進行蛋白的等量上樣。