食用菌液體菌種搖瓶培養(yǎng)技術(shù)！

食用菌液體菌種搖瓶培養(yǎng)技術(shù)！
液體菌種的培養(yǎng)方式主要有振蕩培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)兩類。振蕩培養(yǎng)又稱為搖瓶培養(yǎng)，是利用機械振蕩，使培養(yǎng)液振動而達到通氣的目的，是將斜面試管菌種接種到培養(yǎng)液中，置搖床上振蕩培養(yǎng)。經(jīng)搖瓶培養(yǎng)的菌絲體一般呈球狀、絮狀等多種形態(tài)，培養(yǎng)液呈黏稠狀或清液狀，有或無清香味及其他異味。菌液中因有菌體發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，可呈不同的顏色。發(fā)酵罐培養(yǎng)是利用發(fā)酵罐進行深層液體培養(yǎng)。
采用搖瓶培養(yǎng)液體菌種時，可以采用往復式搖床或者旋轉(zhuǎn)式搖床。往復式搖床的往復頻率一般在80～140r/min，沖程一般為5～14cm，在頻率過快、沖程過大或瓶內(nèi)液體過多時，振蕩使液體容易濺到瓶口紗布上而造成污染。旋轉(zhuǎn)式搖床的偏心距一般為3～6cm，旋轉(zhuǎn)次數(shù)為60～300r/min，它的結(jié)構(gòu)比較復雜，加工安裝要求比往復式搖床高，造價也較貴，但是氧的傳遞好、功率消耗低，培養(yǎng)基一般不會濺到棉塞上。因此，要根據(jù)實際需要選擇合適的搖床及振蕩速度。
1．搖瓶培養(yǎng)的工藝流程 制備培養(yǎng)基一分裝一滅菌一冷卻一接種一搖床培養(yǎng)一一級液體菌種一二級液體菌種。
2．搖瓶培養(yǎng)要點
(1)培養(yǎng)基的配制 按配方稱好各種成分，裝入容器中，加水溶解后，分裝入三角瓶中，一般250～300mL三角瓶裝50mL培養(yǎng)液，500mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)液，塞上棉塞，用報紙包扎；也可用8層紗布做成8cm×8cm的瓶塞封口，外面用牛皮紙封口。
(2)滅菌一般采用高壓滅菌方法，滅菌要求121℃、30min。取出冷卻到30℃左右，放人無菌室或接種箱內(nèi)備用。
(3)接種 按無菌操作要求每瓶接入2～3cm2的斜面菌種一塊，每支斜面菌種可接4～5瓶。接入的菌種稍帶點培養(yǎng)基為好，能使其浮在培養(yǎng)基的表面，接種后用原塞瓶口的紗布展開后蓋在瓶口，并用線繩扎牢。
(4)培養(yǎng)接種好的菌種瓶可置于搖床上培養(yǎng)，也可置于24～26℃恒溫下靜置培養(yǎng)48h后，待氣生菌絲延伸到培養(yǎng)液中后再進行振蕩培養(yǎng)。往復式搖床的振蕩頻率為80～120r/min，旋轉(zhuǎn)式搖床的頻率為150～220r/min，搖床培養(yǎng)3～4d即可。培養(yǎng)結(jié)束時，因菌種不同，培養(yǎng)液出現(xiàn)不同色澤，如平菇、金針菇的培養(yǎng)液呈淺黃色；香菇、猴頭菇的培養(yǎng)液呈紅棕色，并有菇香味；木耳的培養(yǎng)液呈褐色，黏稠有香甜味。培養(yǎng)液經(jīng)檢測，無雜菌污染，菌絲干重達10g/L，菌絲球直徑在1～2mm時，方可用于生產(chǎn)或進一步擴大培養(yǎng)。
(5)二級液體菌種制作 二級液體菌種培養(yǎng)基的制作同一級液體菌種，培養(yǎng)容器要大些，可采用5000mL三角瓶，裝量不超過3500mL。滅菌冷卻后，將已經(jīng)發(fā)酵好的一級液體菌種按5%～10%的比例接入5000mL三角瓶中，置搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速要適當慢些。經(jīng)過一定時間的振蕩培養(yǎng)，就可得到菌球均勻分布、發(fā)酵液清澈透明的液體菌種。
3．影響搖瓶培養(yǎng)的因素
(1)培養(yǎng)溫度食用菌菌絲的增殖及次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生都在各種酶的催化下進行，而酶的催化反應需要適宜的溫度，多數(shù)食用菌的最適溫度在22～30℃范圍內(nèi)。如香菇為25～26℃，金針菇、平菇為22～25℃，靈芝為28～30℃，云芝為30～31℃，猴頭菇為24～26℃。培養(yǎng)溫度過低，菌絲生長緩慢；培養(yǎng)溫度過高，菌絲球松散、稀疏、活力降低、質(zhì)量變差。
(2)搖床的振蕩頻率和搖瓶的裝液量搖床的振蕩頻率和搖瓶的裝液量直接影響到培養(yǎng)液中氧氣的含量。搖床的振蕩頻率越高，搖瓶的裝液量越少，則培養(yǎng)液中溶解氧的含量往往越高。
(3)培養(yǎng)液酸堿度培養(yǎng)液的酸堿度直接影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收、酶活性及菌絲球生長等。培養(yǎng)液的酸堿度必須在滅菌前調(diào)整合適。大多數(shù)藥用真菌的液體發(fā)酵，多采用自然pH或控制在pH5. 0～6.5的范圍內(nèi)。如果需要對培養(yǎng)液pH進行調(diào)節(jié)，可采用低濃度氫氧化鈉及鹽酸進行。為了防止培養(yǎng)液中酸堿度的劇烈變化，也常在培養(yǎng)液中加入碳酸鈣、磷酸鹽等緩沖物質(zhì)。
培養(yǎng)液的酸堿度一般會隨著菌體的生長而變化。發(fā)酵培養(yǎng)到了中期，多數(shù)菌絲會產(chǎn)生一些酸性物質(zhì)如乙酸、檸檬酸、草酸等造成培養(yǎng)液pH下降；到了發(fā)酵后期，有的菌種菌液中pH會回升。一些無機鹽，如碳酸銨被菌絲利用后，會引起pH值下降。葡萄糖作為碳源時，因丙酮酸迅速積累，會引起pH下降；而以乳糖為碳源時因乳糖的吸收較緩慢，pH下降較慢。因此，測定不同菌齡時培養(yǎng)液的pH，對了解菌絲的生長、代謝、生理生化反應等是一項重要的參數(shù)。要精確測定pH，可用酸度計進行，也可用pH試紙先進行粗測。搖瓶培養(yǎng)的pH測定必須將菌液倒出測定。
(4)接入菌種的菌齡接入菌種的菌齡可以影響到搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果。如菌種老化，則生活力降低，搖瓶中菌體的生長速度減弱，形成的菌絲球減少，培養(yǎng)的液體菌種的質(zhì)量則較差。所以，應當選擇生活力旺盛，生長健壯的試管斜面菌種進行搖瓶培養(yǎng)；如果是二級液體菌種制作，則接入的液體菌種的菌齡也不應老化。
(5)接種量搖瓶培養(yǎng)的接種量指一級搖瓶種子對二級搖瓶所接入菌液量與培養(yǎng)液的比值。如對二級搖瓶1000mL的培養(yǎng)液中接入50mL的菌液，稱接種量為5%。這種接種量的計量方法比較粗糙，并不精確。理論上應以接入菌絲的克數(shù)來計量。但在實際操作中因步驟繁雜、易污染而難以實現(xiàn)。一般來講，搖瓶培養(yǎng)的接種量越大，培養(yǎng)周期越短，反之則長。食（藥）用菌液體發(fā)酵的接種量一般在5%～30%，但接種量并非越大越好。例如銀耳孢子的液體發(fā)酵，其最適接種量為5%～10%。生產(chǎn)上的最佳接種量是以目的物的產(chǎn)量及生產(chǎn)成本綜合考慮的結(jié)果。此外，接入菌液的菌絲狀態(tài)將顯著影響菌絲的增殖及次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。一般可采用勻漿器將菌球打碎成菌絲片段或在搖瓶中加入玻璃球?qū)⒕�球分散，菌種接入后方能顯出迅速的增殖效果。
(6)培養(yǎng)液黏度 培養(yǎng)液黏度小，形成的菌絲球大，數(shù)量少，而黏度增加時，菌絲球直徑下降，數(shù)量增多，產(chǎn)量增加。因而要根據(jù)液體菌種對菌絲球直徑的要求，配制一定黏度的培養(yǎng)液，在生產(chǎn)中常加入瓊脂和玉米粉增加黏度。
(7)光照 菌絲生長階段對光線的需要量不高，應盡量避免直射光的照射。
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