一步法Crystal RT-數(shù)字PCR（Crystal RT-dPCR）直接進(jìn)行RNA絕對(duì)定量檢測(cè)

一步法反轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）廣泛用于RNA分析，如基因組表達(dá)、病毒檢測(cè)，從生命科學(xué)研究到診斷的許多領(lǐng)域，都有所應(yīng)用。一步法Crystal RT-數(shù)字PCR實(shí)現(xiàn)了直接對(duì)RNA樣本進(jìn)行多重靶標(biāo)基因的檢測(cè)（內(nèi)參基因、多重目標(biāo)基因）和病毒RNA的絕對(duì)定量，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)的細(xì)微差異的精確檢測(cè)。
一步法Crystal RT-數(shù)字PCR技術(shù)（Crystal RT-dPCR）實(shí)現(xiàn)了同一個(gè)反應(yīng)中，通過(guò)三個(gè)熒光通道進(jìn)行三種不同的mRNA分析，可以顯著且準(zhǔn)確地區(qū)分1.5倍的基因表達(dá)差異（圖1）。
圖1：一步法Crystal RT-數(shù)字PCR（Crystal RT-dPCR）對(duì)人總RNA中mRNAs進(jìn)行絕對(duì)定量
 對(duì)人總RNA進(jìn)行1.5倍倍比稀釋，濃度變化范圍0.06ng/µl-3.6ng/µl，通過(guò)一步法Crystal RT-數(shù)字PCR對(duì)GUSB、ALB和TSN的三種mRNA進(jìn)行三重絕對(duì)定量檢測(cè)。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix® 和FAM-、HEX和Cy5-標(biāo)記的三種TaqMan^TM 探針。重復(fù)三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示每個(gè)靶標(biāo)基因均具有良好的線性，準(zhǔn)確性和再現(xiàn)性。GUSB = 588. 8 cp / ng：ALB = 96.5 cp / ng：TSN = 980.6 cp / ng 
低表達(dá)水平轉(zhuǎn)錄子的定量檢測(cè)
對(duì)于背景高的總RNA中低豐度轉(zhuǎn)錄子的檢測(cè)極具挑戰(zhàn)，使用Crystal數(shù)字PCR技術(shù)在檢測(cè)低比例的轉(zhuǎn)錄子定量檢測(cè)具有出色的線性和重復(fù)性（圖2A）。即使在高濃度總RNA背景的情況下熒光強(qiáng)度一致，反應(yīng)效率不受影響（2μg-圖2B）。 對(duì)人總RNA進(jìn)行2倍倍比稀釋，濃度變化范圍從2 µg 到125 ng，通過(guò)一步法Crystal RT-數(shù)字PCR對(duì)ALB的mRNA進(jìn)行絕對(duì)定量。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix®和HEX-標(biāo)記的TaqMan^TM 探針。
線性圖顯示重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性（A），并且在微滴熒光散點(diǎn)圖中未觀察到熒光的變化（B）。 RFU：相對(duì)熒光單位。 *每次反應(yīng)27μL。
病毒RNA的絕對(duì)定量
登革熱1型病毒DEN-1和其他三種相近的血清型可以產(chǎn)生致命風(fēng)險(xiǎn)，如登革熱出血熱、登革熱休克綜合征。一步法Crystal RT-數(shù)字PCR，可以實(shí)現(xiàn)2.5個(gè)小時(shí)內(nèi)，在無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下，對(duì)登革熱病毒載量進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)，快速，友好且適用于所有實(shí)驗(yàn)室和工作流程。 

圖3：一步法Crystal RT-數(shù)字PCR絕對(duì)定量DEN-1病毒載量 

將DEN-1病毒RNA（制造商通過(guò)數(shù)字PCR定量的標(biāo)準(zhǔn)品）中摻入300cp人總RNA作為背景，以ABL mRNA作為內(nèi)參。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix®，F(xiàn)AM探針檢測(cè)DEN-1病毒，HEX探針檢測(cè)ABL基因。線性擬合程度達(dá)0.99，重復(fù)性好。

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