HPLC故障排除1 - 峰形問題

1. 峰形
1.1.在RP-HPLC應(yīng)用之初，峰拖尾就是最常見的峰形問題（拖尾峰是RP-HPLC自出現(xiàn)以來最普遍的峰形問題）。

大多數(shù)峰拖尾是由于柱內(nèi)硅膠顆粒表面上的酸性或離子化硅烷醇基團(tuán)之間相互作用而導(dǎo)致的。

低純度硅膠（通常稱為“A型”或酸性硅膠）具有高含量的酸性硅烷醇（-Si-OH）基團(tuán)，其富含的金屬雜質(zhì)（特別是鐵和鋁）可提供陽離子交換位點(diǎn)，進(jìn)一步促使這些基團(tuán)電離成-Si-O-。

這些材料的pKa在pH4-5區(qū)域中，這意味著在pH>6時(shí)，大部分硅烷醇基團(tuán)會(huì)被電離（已離子化）。

通過提高純度并降低硅膠的酸度可獲得更高純度的硅膠顆粒（“B型”），并且自引入（其出現(xiàn)）以來，這些硅膠填料的純度已經(jīng)得到了改善（有所提高）。

高純度硅膠的pKa> 8，因此對(duì)于大多數(shù)色譜柱，在2 堿性化合物極易受到硅醇拖尾（影響而導(dǎo)致拖尾），并且由于大多數(shù)樣品分子含有堿性氮官能團(tuán)，所以沒有多少（很少有）化合物可以完全對(duì)硅醇交互作用免疫（不受硅醇基的影響）。

圖1顯示了硅醇拖尾的情況。甲苯是一種中性化合物，不會(huì)產(chǎn)生硅醇拖尾現(xiàn)象，但圖1中剩余（其他）的分析物為強(qiáng)堿性藥物。

流動(dòng)相pH值是6，這是影響分離的另一個(gè)因素，它會(huì)使純度較低的硅膠色譜柱出現(xiàn)硅烷醇離子化現(xiàn)象（對(duì)于該分析更大的挑戰(zhàn)在于流動(dòng)相pH=6，這一條件下低純度硅膠色譜柱的硅醇基已離子化）。

低純度硅膠（“A型”硅膠）（圖1a）會(huì)與堿發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，致使分析物不會(huì)從柱上洗脫下來（以至不能從色譜柱中洗脫這些分析物）。

早期的B型材料（圖1b）顯著改善了峰形，盡管它們均出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，但樣品中的所有峰形均可見（可以看到樣品中所有分析物出峰）。

通過進(jìn)一步改善（提高）硅膠純度（圖1c），可使峰拖尾降低至可接受的水平。

只要在RP-HPLC中使用含硅烷醇的硅膠，就不可能消除峰拖尾現(xiàn)象。

雖然使用高純度硅膠色譜柱是改善硅烷醇拖尾的最佳辦法，但仍存在其它解決拖尾現(xiàn)象的技術(shù)（技術(shù)可以減少拖尾）。

近年來，多采用將三乙胺（TEA）（一種�。ǖ停┓肿恿繅A）加入到流動(dòng)相（例如25mM）中的方法改善峰拖尾。

TEA是酸性硅烷醇基團(tuán)的有力競爭者，但對(duì)于當(dāng)今的高純度硅膠，幾乎無需或很少使用TEA。

圖1：

圖1. 硅膠純度和峰拖尾(a) 低-、(b) 中-、和(c) 高-純度硅膠。

色譜柱：250x4.6mm, 5m；

流動(dòng)相：80:20 MeOH/25mM KH2PO4(pH 6.0)；
流量：1.0 mL/min；

成分：1, 去甲麻黃堿；2, 去甲替林；3, 甲苯；4, 丙咪嗪；5, 阿米替林。

 

1.2.緩沖液或流動(dòng)相添加劑不足也會(huì)導(dǎo)致峰拖尾。

緩沖液主要用來使樣品處于（保持）恒定的離子化狀態(tài)，從而穩(wěn)定保留情況（時(shí)間），并在最大程度上減少因離子相互作用而導(dǎo)致的峰拖尾現(xiàn)象。

緩沖液還可抑制硅膠表面上的硅烷醇基團(tuán)的電離現(xiàn)象（的硅醇基離子化）。

但是對(duì)于低純度硅膠材料來說，由于其硅烷醇更容易被電離，所以它的挑戰(zhàn)性更高（當(dāng)然，這對(duì)于低純度的硅膠材料是更大的挑戰(zhàn)，因?yàn)榭赡芨�多硅醇基�?huì)離子化的）。

添加劑濃度對(duì)峰形的影響如圖2所示。

在這種情況下，三氟乙酸（TFA）會(huì)作為蛋白質(zhì)樣品成分的離子對(duì)試劑，也會(huì)產(chǎn)生（可提供）低pH流動(dòng)相以抑制硅烷醇電離。

通常，0.1％TFA可以（作為添加劑）用于蛋白質(zhì)和肽分離。

如圖2a和b所示，該濃度足以在最大程度上改善高純度和中純度硅膠柱的拖尾現(xiàn)象。

然而，如果TFA濃度下降（降低）十倍（圖2c，d），兩個(gè)相（兩個(gè)固定相）的拖尾均會(huì)隨之增加。高純度硅膠仍可（仍然）保持可接受的峰形，但中純度色譜柱的峰拖尾則無法接受。

緩沖液和其它流動(dòng)相添加劑的一個(gè)共同特征是：作用效果（例如峰拖尾的減少、保留時(shí)間的穩(wěn)定）會(huì)從低濃度開始（開始顯現(xiàn)），并隨著濃度的增加而繼續(xù)作用（增加），但會(huì)逐漸（趨平）維持在一個(gè)穩(wěn)定水平。

穩(wěn)定水平之下的添加劑濃度，可以保持穩(wěn)定的運(yùn)行；濃度過高會(huì)產(chǎn)生（可能導(dǎo)致）溶解性問題。

對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用來說，10-25mM內(nèi)的添加劑已經(jīng)足夠了，但最好根據(jù)具體情況確定。

圖2. 緩沖液濃度對(duì)峰拖尾的影響。

0.1％TFA與（a）高純度（b）中純度硅膠柱；0.01％TFA與（c）高純度和（d）中純度硅膠柱。

色譜柱：250x4.6mm, 5m, C18 300Å；

流動(dòng)相：A: 0.1%或0.01%的TFA溶于水中；B: 0.1%或0.01%的TFA溶于ACN；5-70% B，30分鐘；

流量：1.0 mL/min, 280nm。

成分（保留順序）：核糖核酸酶A、細(xì)胞色素C、全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫輔基肌紅蛋白。

 

1.3.色譜圖中所有峰拖尾或峰變形通常是由物理作用導(dǎo)致的，而非化學(xué)作用。

如果色譜圖中的峰形均表現(xiàn)相同類型的變形（圖3），則問題最早應(yīng)出現(xiàn)在分析物通過色譜柱遷移之前（主要問題發(fā)生在分析物在色譜柱中遷移之前）。

這種峰形變形最常見的致因是：玻璃料或柱頭的空隙部分堵塞（此類峰變形最常見的原因是篩板部分堵塞或色譜柱頭塌陷）。

除非在推薦的pH范圍之外使用色譜柱，否則現(xiàn)在的柱子基本不會(huì)受到空隙的影響（輕易不會(huì)發(fā)生塌陷）。

但是，玻璃料（篩板）堵塞仍然是一個(gè)普遍存在的問題。對(duì)于5m顆粒柱（的色譜柱），入口端的玻璃料（篩板）通常具有2.0m的孔隙度；對(duì)于（顆粒）3m的色譜柱，具有0.5m的孔隙度。
如果顆粒物來自于樣品，或顆粒物是因泵密封磨損或流動(dòng)相到達(dá)色譜柱而產(chǎn)生的（磨損的泵密封圈或者流動(dòng)相顆粒物進(jìn)入色譜），它們通常會(huì)集中在玻璃料上（都聚集在篩板上）。

這些顆粒會(huì)影響樣品在色譜柱入口端的分流，使得部分樣品通過不同的流動(dòng)路徑到達(dá)色譜柱，因此會(huì)晚于另一部分樣品。
由于此時(shí)（此位置）未發(fā)生分離，因此所有分析物會(huì)以相同的方式變形（被擾亂），進(jìn)而色譜圖顯示所有峰均具有相似（類似）的峰拖尾或變形。

為了防止（避免）這一問題，如果流動(dòng)相可能含有顆粒（如緩沖沉淀物或灰塵），應(yīng)對(duì)其進(jìn)行過濾；并在泵密封嚴(yán)重磨損（導(dǎo)致顆粒物的產(chǎn)生）之前更換新的泵密封（密封圈）。

如果樣品含有顆粒碎片（屑），應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行過濾（例如0.5m孔隙度過濾器（微孔濾膜））或?qū)ζ溥M(jìn)行短暫離心（例如5分鐘，>1500×g），以去除顆粒。

我們強(qiáng)烈建議在自動(dòng)進(jìn)樣器下游（之后）安裝0.5m孔隙度的串聯(lián)（在線）過濾器，以過濾任何意外進(jìn)入HPLC系統(tǒng)的顆粒物。如果串聯(lián)（在線）過濾器玻璃料（濾片）發(fā)生堵塞，系統(tǒng)背壓會(huì)升高；而更換玻璃料（濾片）十分簡單、快速和經(jīng)濟(jì)。采用串聯(lián)（在線）過濾器可顯著延長色譜柱的使用壽命，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

圖3. 由于玻璃料或色譜柱空隙被部分堵塞（色譜柱篩板部分堵塞或色譜柱塌陷），色譜圖中所有峰形均出現(xiàn)了變形。

 

1.4.如果峰形解析不正確（未完全分離的重疊峰），可能會(huì)被誤認(rèn)為柱（色譜柱）或緩沖液的問題。

如果僅部分解析兩個(gè)峰形（兩個(gè)峰僅有部分分開），則可能會(huì)認(rèn)為其是裂峰或雙峰。如圖4顯示的情形。

在圖4a中，可觀察到與圖3極為類似的峰值變形（峰變形），其表明玻璃料被堵塞（篩板堵塞）。

改變柱并未糾正這個(gè)問題（更換色譜柱不能解決此問題），所以玻璃料（篩板）堵塞并非導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因。如果柱上樣品的質(zhì)量減少（減少上樣量）（圖4b），峰形看起來更像是兩個(gè)峰，而不是一個(gè)肩形峰。

這便需要進(jìn)一步研究，以確定是否存在第二個(gè)峰�？梢酝ㄟ^修改方法條件來完全分離兩個(gè)峰（由此進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，證實(shí)了存在第二個(gè)峰。

調(diào)整方法的條件后，兩個(gè)峰完全分離）。

圖4. 由于存在第二個(gè)組分而產(chǎn)生分裂峰。

（a）25ng / mL，和（b）等離子體中10ng/ mL的藥物（第二個(gè)峰）（10 ng/mL血漿中的藥物（第二個(gè)峰））。來源[1]。

 

1.5.由于目前的色譜柱性能優(yōu)良，因此極不可能出現(xiàn)伸舌峰（伸舌峰的現(xiàn)象隨著現(xiàn)今柱填充技術(shù)的提高已相當(dāng)少見）。

伸舌峰一般是由柱過載或柱結(jié)構(gòu)塌陷導(dǎo)致的（發(fā)生伸舌峰的一個(gè)原因是色譜柱內(nèi)發(fā)生溝流或色譜柱結(jié)構(gòu)的坍塌）。

如果在制造商推薦的條件下使用色譜柱，這種情況則很少發(fā)生。

大多數(shù)硅膠柱在pH2-8的范圍內(nèi)可以保持穩(wěn)定。

pH低于2時(shí)，鍵合相會(huì)發(fā)生水解；pH高于8時(shí)，硅膠會(huì)溶解。

如果（如果您需要）在此pH范圍以外使用（操作）HPLC系統(tǒng)，請(qǐng)確保選擇在選定條件下會(huì)保持穩(wěn)定的色譜柱。

圖5顯示了因柱過載（色譜柱發(fā)生溝流）導(dǎo)致的伸舌峰。

圖5a中顯示了正常的峰值形（峰形）;在大約500次注射（進(jìn)樣）后，觀察到伸舌峰（圖5b）。

使用這種方法便會(huì)出現(xiàn)這種變化，并且在每次運(yùn)行的過程中會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)（這種改變是該方法所特有，經(jīng)常在前一次分析結(jié)束后，下一次分析開始時(shí)突然發(fā)生）。

出現(xiàn)伸舌峰后，唯一有效的解決辦法就是更換色譜柱。

該柱為100x2.1mm（直徑（內(nèi)徑）），色譜柱填充5mC18顆粒（柱內(nèi)填充5μm 粒徑的C18填料） 。流動(dòng)相A是10mM碳酸氫銨（pH9.0） ； B是甲醇（MeOH）。

該方法包括5％B等度洗脫段，接下來是80％B的沖洗（然后用80%B淋洗）。

這種特殊的色譜柱可專門用于高達(dá)100％的水流動(dòng)相，且無封端。

當(dāng)流動(dòng)相pH值升高時(shí)，封端可保護(hù)硅膠免于溶解。

在這種情況下，所使用的色譜柱流動(dòng)相pH應(yīng)遠(yuǎn)高于推薦的范圍，并且無需保護(hù)性封端。硅膠在pH為9時(shí)會(huì)逐漸溶解，直到柱床結(jié)構(gòu)不再穩(wěn)定，并且柱床會(huì)發(fā)生移動(dòng)，
產(chǎn)生空隙（塌陷）或通道，而這又會(huì)導(dǎo)致圖5b伸舌峰的形成。

可以使用較低的流動(dòng)相pH或采用在較高pH下能夠保持穩(wěn)定狀態(tài)的色譜柱，以避免這一問題（避免這一問題）。

圖5. 過載導(dǎo)致的伸舌峰。（a）正常的峰形；（b）伸舌峰。來源[2]。