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DELFIA經(jīng)典技術(shù)應(yīng)用于單抗研發(fā)及細(xì)胞治療——AD0116細(xì)胞殺傷專題之ADCC
DELFIA經(jīng)典技術(shù)應(yīng)用于單抗研發(fā)及細(xì)胞治療——AD0116細(xì)胞殺傷專題之ADCC
ADCC簡介
Fc區(qū)域主要介導(dǎo)以下三類活動(dòng)：
1. 通過結(jié)合表達(dá)在Natural killer (NK)等免疫細(xì)胞表面上的FcγR（Fcγ receptors）激活抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）
2. 通過結(jié)合血清補(bǔ)體C1q激活補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用（Complement-dependent?cytotoxicity，CDC）
3. 通過結(jié)合新生兒Fc受體（Neonatal Fc receptor ，F(xiàn)cRn）延長抗體半衰期。
今天我們主要關(guān)注ADCC，其不僅是機(jī)體通過抗體清除被病毒或其他病原物感染細(xì)胞的主要途徑，也是目前治療性抗體發(fā)揮臨床效果的（Mechanism of Action ，MOA）核心機(jī)制之一[1]。因此，對于抗體新藥研發(fā)和改造，仿制藥開發(fā)和研發(fā)過程中抗體質(zhì)量及功能的分析，都離不開ADCC的檢測。同時(shí)，在生物藥和免疫調(diào)節(jié)藥物的臨床試驗(yàn)中，ADCC活力也是必須的ex vivo指標(biāo)之一。在此，我們以ADCC檢測為切入點(diǎn)，向大家展示珀金埃爾默的DELFIA技術(shù)平臺(tái)是如何助力抗體制藥的。
圖片引用自參考資料[1]
基于DELFIA技術(shù)的ADCC檢測
從細(xì)胞水平來說，ADCC本質(zhì)上屬于免疫細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷。因此，常見的針對細(xì)胞殺傷（注意不是細(xì)胞活力）的檢測方式，如經(jīng)典的51Cr釋放法，LDH檢測，和Calcein 釋放法等都可以用于ADCC檢測。從原理上，這些方法可分為直接的檢測靶細(xì)胞在效應(yīng)免疫細(xì)胞作用下的裂解程度，如51Cr釋放法；和間接的檢測效應(yīng)細(xì)胞的活化，如NFAT-RE-luc報(bào)告基因法和監(jiān)測剩余的細(xì)胞活力來評估細(xì)胞殺傷，如化學(xué)發(fā)光法等。間接法的缺點(diǎn)是不能直接模擬體內(nèi)ADCC過程。利用DELFIA技術(shù)的DELFIA® EuTDA（貨號AD0116）細(xì)胞毒法屬于直接檢測法，更能反映ADCC的MOA。與51Cr釋放法形式類似，DELFIA® EuTDA細(xì)胞毒法利用熒光放大配體BATDA特異的標(biāo)記靶細(xì)胞。BATDA能迅速進(jìn)入細(xì)胞，并在水解作用下形成親水的TDA留在細(xì)胞內(nèi)，并在靶細(xì)胞裂解下釋放，和DELIFA Eu試劑相結(jié)合形成強(qiáng)熒光、穩(wěn)定的螯合物EuTDA用于檢測。更詳細(xì)的原理介紹可參考我們的微信端公眾號[2]和應(yīng)用材料[3]。
圖片引用自參考資料[3]
作為放射性檢測的替代方法，更為安全的DELFIA® EuTDA細(xì)胞毒法在ADCC活力檢測中具有眾多優(yōu)勢。相較于無法區(qū)分非特異死亡的LDH檢測，EuTDA法不受效應(yīng)細(xì)胞死亡和裂解的影響，降低背景的同時(shí)提升了檢測的窗口和穩(wěn)定性。相較于Calcein，BATDA能有效標(biāo)記脆弱細(xì)胞，迅速被細(xì)胞攝取和在細(xì)胞裂解下完成高效的釋放，為ADCC檢測提供了穩(wěn)定的檢測窗口和易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)勢。同時(shí)，EuTDA細(xì)胞毒法不受效應(yīng)細(xì)胞限制，靈活支持利用多種原代免疫細(xì)胞（如PBMC和NK細(xì)胞）和更為穩(wěn)定的改造細(xì)胞系的ADCC檢測。從檢測模式上EuTDA方法為時(shí)間分辨熒光（Time-Resolved Fluorescence，TRF），因此擁有TRF本身的眾多優(yōu)勢，包括不受來源于培養(yǎng)基和血清等的背景熒光干擾，高穩(wěn)定性和重復(fù)性等。此外，靶向紅外區(qū)的檢測能有效避免檢測樣本來帶的干擾，并為多重檢測打下基礎(chǔ)。最后，對自動(dòng)化和小型化的支持已讓EuTDA法逐漸成為大分子藥物研發(fā)中ADCC檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法[4]。在此，我們通過幾個(gè)經(jīng)典案例向大家介紹基于DELFIA技術(shù)的ADCC檢測是如何助力大分子藥物研發(fā)的。
單抗研發(fā)領(lǐng)域之Fc區(qū)域改造
在此，我們向大家介紹抗體改造的先河研究[5]。在結(jié)構(gòu)解析的基礎(chǔ)上，該研究引入AlphaScreen高通量篩選平臺(tái)，通過競爭法鑒定出FcγRIIIa高親和力的Fc區(qū)域變體。AlphaScreen的親和力結(jié)果進(jìn)一步由Biacore SPR 確認(rèn)。除了檢測變體和FcγRIIIa之間的親和力，AlphaScreen還用于確認(rèn)變體和抑制性IgG受體FcγRIIb之間的親和力，從而獲得變體和RIIIa/RIIb的相對親和力比值。結(jié)果顯示A330L 突變和S239D/I332E相結(jié)合能提高對激活性FcγRIIIa的親和力的同時(shí)降低和抑制性受體FcγRIIb之間的親和力，顯著提升RIIIa/RIIb的相對親和力比值（4->9, 針對Trastuzumab）。
在親和力篩選的基礎(chǔ)上，研究利用DELFIA EuTDA-based cytotoxicity assay（貨號AD0116）在細(xì)胞水水平探究變體對ADCC的提升。以不同F(xiàn)cγRIIIa基因型的PBMCs為效應(yīng)細(xì)胞，Her2+ SkBr3為靶細(xì)胞，研究證明改造的變體能有效提升ADCC（2-3個(gè)數(shù)量級），與親和力數(shù)據(jù)趨勢一致（下圖左）。進(jìn)一步的研究證明變體能有效引發(fā)針對HER-2不同表達(dá)水平的細(xì)胞株的ADCC。針對幾乎沒有抗原表達(dá)的MCF7細(xì)胞系，變體依然具有客觀的ADCC活力（下圖右）。
除了基因水平多態(tài)性外，Fc區(qū)域的糖基化也影響其和FcγR的親和力。尤其是巖藻糖的缺失會(huì)提升IgG1和FcγRIIIa之間的親和力。因此，除了突變外，改造Fc區(qū)域的糖基化修飾也是提升治療性抗體ADCC活力的一個(gè)途徑。以由羅氏研發(fā)的Lumretuzumab單抗（RG7116）為例[6]。RG7116一方面阻斷HER3的激活并下調(diào)HER3的表達(dá)。進(jìn)一步通過羅氏去巖藻糖修飾的GlycoMab技術(shù)改造，RG7116和FcγRIIIa之間的結(jié)合親和力提高50倍�；�DELFIA技術(shù)的ADCC檢測證明，糖基化改造顯著提升RG7116的ADCC活力（下圖左）。同時(shí)，對比不同HER3表達(dá)量的細(xì)胞系，研究清晰地表明HER3受體表達(dá)豐度和RG7116介導(dǎo)的ADCC活力之間的正相關(guān)聯(lián)系（下圖右）。在動(dòng)物模型上，基于多種低免疫細(xì)胞浸潤的小鼠皮下瘤模型，研究發(fā)現(xiàn)RG7116僅通過靶向HER3就能發(fā)揮抗癌作用。進(jìn)一步利用高免疫細(xì)胞浸潤的異種原位移植A549肺癌小鼠模型，研究證明糖基化改造有效提升小鼠的生存周期。臨床一期試驗(yàn)進(jìn)一步證明RG7116的臨床療效。一方面，RG7116有效抑制了腫瘤細(xì)胞膜HER3的表達(dá)。同時(shí)，相較于未糖基化改造的抗體，RG7116升高外周NK免疫細(xì)胞的活化程度[7]。
雖然同是單抗藥物，PD-1抑制劑與常見的靶向藥物作用機(jī)制不同。PD-1抗體主要用于阻斷PD-1和其配體PD-L1的相互作用，而不是殺傷PD-1陽性細(xì)胞，也就是抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞。在Nivolumab的體外表征分析研究中，DELFIA Cell Cytotoxicity Kit（貨號AD0116）被用于確認(rèn)Nivolumab是否會(huì)誘導(dǎo)ADCC產(chǎn)生。以活化的PBMCs為效應(yīng)細(xì)胞，高表達(dá)PD-1的CD4陽性細(xì)胞為靶細(xì)胞，研究人員確認(rèn)IgG4亞型的nivolumab不會(huì)誘發(fā)ADCC效應(yīng)[8]。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明nivolumab不能介導(dǎo)CDC，因此nivolumab的引入不會(huì)清除PD-1陽性細(xì)胞群體。除了nivolumab外，其他的PD-1單抗，包括默沙東的Keytruda、百濟(jì)神州的BGB-A317及恒瑞的SHR-1210,都為弱ADCC活性設(shè)計(jì)。然而，同樣是免疫檢查點(diǎn)抑制劑，CTLA-4單抗Ipilimumab則需要其ADCC活性來殺傷Treg細(xì)胞發(fā)揮作用，強(qiáng)調(diào)了不同作用機(jī)制對抗體ADCC活性的要求也有區(qū)別[9]。
ADCC活力的檢測不僅能協(xié)助解析單抗藥物的MOA，也推動(dòng)對于NK細(xì)胞功能的研究及開辟新的抗腫瘤策略。作為成熟的細(xì)胞殺傷檢測工具，DELFIA® EuTDA（貨號AD0116）細(xì)胞毒法不僅可用于評估抗體的ADCC和CDC活力，還能用于檢測ACT，CAR-T和CAR-NK等療法中免疫細(xì)胞的殺傷能力。為了助力免疫治療的開發(fā)，我們近期推出“珀金埃爾默生命科學(xué)試劑耗材平臺(tái)”，加速您的研究和藥物開發(fā)進(jìn)程。
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參考資料
[1] Deyev SM, Lebedenko EN. Modern Technologies for Creating Synthetic Antibodies for Clinical Application.Acta Naturae. 2009 Apr;1(1):32-50.
[2] 科研干貨|免疫細(xì)胞如何殺傷腫瘤細(xì)胞. https://mp.weixin.qq.com/s/-jW77oFnXusb9h6e-AKQBg
[3] A Simplified, Gentle Cell-Labelling Method for Non-Radioactive Cytotoxicity Assays. PerkinElmer application note
[4] An Automated DELFIA ADCC Assay Method using a CD16.NK-92 Cell Line. Biotek application note
[5] Lazar GA, et al.Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10.
[6] Mirschberger C, et al. RG7116, a TherapeuticAntibody That Binds the Inactive HER3 Receptor and Is Optimized for Immune Effector Activation. Cancer Res. 2013 Aug 15;73(16):5183-94.
[7] Meulendijks D, et al. First-in-Human Phase I Study of Lumretuzumab, a Glycoengineered Humanized Anti-HER3 Monoclonal Antibody, in Patients with Metastatic or Advanced HER3-Positive Solid Tumors.Clin Cancer Res. 2016 Feb 15;22(4):877-85.
[8] Wang C, et al. In Vitro Characterization of the Anti-PD-1 Antibody Nivolumab, BMS-936558, and In Vivo Toxicology in Non-Human Primates. Cancer Immunol Res. 2014 Sep;2(9):846-56.
[9] Romano E, et al. Ipilimumab-dependent cell-mediated cytotoxicity of regulatory T cells ex vivo by nonclassical monocytes in melanoma patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 May 12;112(19):6140-5.
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