基因編輯進展梳理 Part II 基于CRISPR-Cas9的技術應用篇(下)
一、大規(guī)模基因功能的篩選
盡管測序和基因組編輯技術取得了重大進展，但是解析復雜的基因型-表型關系仍然是數(shù)量遺傳學的一個主要障礙。作為強大的基因編輯工具，CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠在蛋白編碼基因的外顯子區(qū)域產生移碼突變而徹底破壞蛋白表達及功能，這一特性被廣泛應用于基因的大規(guī)模功能性篩選研究，這也將大大加速評估基因變異的功能影響。
1. 利用CRISPRa構建無偏向性的耐藥相關LncRNA篩選平臺
2018年4月Cell期刊上刊登一項研究開發(fā)了一種開創(chuàng)性的方法來鑒定和確定在急性髓細胞白血�。ˋML）中l(wèi)ncRNA在化療藥物產生耐藥性中所起的功能作用。這一技術通過結合公開可獲得的藥理學數(shù)據(jù)庫的信息與CRISPR技術，篩選影響治療反應的編碼基因和非編碼基因。作為一種全基因組篩查平臺，既不偏向于編碼基因，也不偏向于非編碼基因，能夠篩選到新的治療靶標[1]。
2. 利用一一配對的靶點-模板策略實現(xiàn)全基因組高效精準突變
理解DNA突變體的功能效應對于基礎生物學、進化生物學和醫(yī)學遺傳學的研究至關重要；盡管CRISPR-Cas9技術可以實現(xiàn)體內數(shù)以千計細胞發(fā)生多基因誘導突變的可能，然而高通量測序這些突變體的特異性仍然是技術的瓶頸。2018年4月Nat Genet期刊刊登了一篇研究，通過改造CRISPR-Cas9系統(tǒng)，解決了目前高通量測序數(shù)以萬計基因組編輯結果的這一壁壘，開發(fā)了一種基于CRISPR的全基因組高效精確突變工程的方法。如圖所示，通過構建10000對編碼gRNA靶向序列及其相應的順式修復模板的質粒文庫來實現(xiàn)靶點和模板的一一配對，將文庫遞送到酵母細胞中監(jiān)測基因突變的影響，突變效率高達95 %。這一策略可以高效精確地追蹤大量基因突變對細胞功能的影響，為研究基因的功能提供了強有力的分析工具[2]。
3. Guide+donor：利用CRISPR-Cas9在酵母中高通量構建和功能分析DNA序列變異文庫
2018年5月，哈佛基因編輯大牛Church研究組在Nature Biotechnology發(fā)文，介紹了一種基于Cas9的方法，在酵母中高效（80-100％）產生特定遺傳變異（缺失、替換和插入）的突變體文庫，以及整體跟蹤其適應性的方法。使用guide+donor方法精確地剔除了酵母基因組中的315個基因，并評估和鑒定了對細胞適應性存活中起重要作用的基因。新的方法不僅能以高通量的方式在酵母菌中精確地進行功能基因組研究，還能深入挖掘低頻基因突變及非編碼序列的基因功能，為基因功能分析打開了新的大門[3]。
4. CHAnGE：一種基于CRISPR-Cas9和同源定向修復相關的大規(guī)�；蚪M篩選方法
2018年7月，美國伊利諾伊大學趙惠民研究組在Nature Biotechnology發(fā)文，開發(fā)了一種基于CRISPR - Cas9和同源定向修復相關的大規(guī)�；蚪M篩選方法CHAnGE，可以在全基因組范圍快速產生成千上萬種精確的酵母單核苷酸突變體，追蹤基因突變對細胞的影響，突變效率超過98 %。該研究通過創(chuàng)建全基因組基因突變集合驗證了該方法對單核苷酸分辨率基因組編輯的可行性，解決了之前的方法編輯效率局限性的問題。該方法能夠對釀酒酵母進行全基因組規(guī)模的快速工程化，并進行精確和可追蹤的基因突變[4]。
5. MAGESTIC：一種在酵母中可追蹤基因組條形碼的多重精確基因組編輯技術
2018年7月，美國斯坦福大學的 Steinmetz LM課題組在Nature Biotechnology發(fā)文，開發(fā)了一種基于Cas9技術利用短的、可追蹤的整合性細胞條形碼（MAGESTIC）在釀酒酵母中進行多重精確基因組編輯的方法。MAGESTIC使用合成的陣列gRNA-donor的寡核苷酸的質粒系統(tǒng)進行高通量編輯，具有基因組條形碼整合的功能，可以防止質粒條形碼的丟失，維持穩(wěn)定的表型。利用LexA - FKH1P融合系統(tǒng)將供體DNA主動招募到DNA斷裂部位的方法，可以提高同源重組的效率。并且相比donor融合到Cas9的方式具有更大的優(yōu)勢，一方面可以招募更多拷貝的donor，同時還不依賴于Cas9與DSBs的持續(xù)關聯(lián)。這一技術克服了目前可行方法的幾個限制，即質粒條形碼的不穩(wěn)定性，以及在表型分析期間無法區(qū)分靶向RNA和供體模板中的Oligo合成和PCR或測序引起的錯誤。MAGESTIC技術將廣泛用于揭示酵母表型的遺傳基礎[5]。
6. 基于CRISPRi的高通量技術快速繪制人類基因的功能圖譜
2018年7月，Cell刊登了美國加州大學舊金山分校的研究小組的研究成果，開發(fā)了一種基于CRISPR的高通量技術快速地繪制人細胞中將近500個基因的功能圖譜，其中的許多基因之前從未被詳細地研究過。人類目前研究過的基因還不到10％，剩余的基因功能我們還一無所知。傳統(tǒng)測試基因功能所需的方法既昂貴又耗時。開發(fā)一種快速而又全面地確定這些未經研究的基因功能將有助于科學家對生物學的更廣泛理解。該研究使用了一種被稱作基因相互作用圖譜（genetic interaction mapping）的技術，用于建立對人體中基因功能的全面解析。利用一種被稱作CRISPR抑制（CRISPRi）的工具，能夠在不編輯DNA本身的情況下降低基因活性，系統(tǒng)性地關閉單個細胞中的成對基因并測量細胞如何作出反應，闡釋這兩個基因之間的關系，能夠快速地歸類未知功能的基因。利用這一系統(tǒng)，研究人員鑒定出了參與細胞能量產生的新基因，并解釋了為何一些膽固醇藥物可用于治療骨質疏松癥而相關藥物沒有這種效果的長期謎團。該研究最終的目的將計劃繪制整個人類基因組中的全基因功能框架[6]。
7. EvolvR：一種結合CRISPR和DNA聚合酶來促進細胞內特定基因進化的平臺
2018年8月，加州大學伯克利分校創(chuàng)新基因組學研究所在Nature上發(fā)文，提出了一種可以利用自然進化力量的變革性新方法---一個促進細胞內特定基因進化的平臺。他們將這個新系統(tǒng)命名為“EvolvR”，這一系統(tǒng)是將Cas9同一種DNA聚合酶融合，利用一種nicking-Cas9只切割兩條DNA鏈中的一條，形成的特殊切口會通過聚合酶補齊。DNA聚合酶補齊的過程會產生錯誤，導致出現(xiàn)各種不同類型的突變。因此聚合酶這種錯誤能帶來更多的基因多樣性，利用EvolvR人為地制造隨機突變，創(chuàng)造數(shù)百萬種不同的序列組合，從中發(fā)現(xiàn)許多人為需要的突變物種。這一系統(tǒng)甚至可以實現(xiàn)在一次實驗中得到數(shù)千種不同的基因多樣化，創(chuàng)造出全新的功能，而不僅僅是打開和關閉基因[7]。
8. Pro – Codes：利用蛋白質條形碼技術高分辨率分析數(shù)百種基因功能的系統(tǒng)
2018年10月，上來自西奈山醫(yī)院的研究人員在Cell期刊發(fā)文，開發(fā)了一種在蛋白質水平上的條形碼系統(tǒng)( Pro - Codes)，使用線性表位的組合來創(chuàng)建更高倍數(shù)的蛋白質條形碼，可以同時分析數(shù)百種基因功能，分辨率可達單細胞水平。利用合成蛋白“抗原決定簇（epitopes）”標記和追蹤不同的CRISPRs，Pro-codes能同時兼容數(shù)百個CRISPRs以敲除大量基因，并通過質譜流式細胞技術進行分析。目前利用DNA作為條形碼的基因篩選技術僅能實現(xiàn)有限的表型和粗略的細胞分辨率。新型Pro-Codes技術能夠以單細胞分辨率同時對100個基因進行高維蛋白質水平的表型分析，可以更全面地描述單個基因的生物學效應[8]。
9. 通過CRISPR-Cas9靶向剪切位點來全基因組篩選功能性LncRNA新策略
2018年11月，為彌補之前建立的基因組大片段刪除、CRISPRi和CRISPRa等方法進行l(wèi)ncRNA的高通量功能性篩選在效率、質量（假陽性、假陰性）上的不足，北大魏文勝課題組在Nature Biotechnology雜志發(fā)文提出了一種新的篩選策略，通過構建特異性靶向基因的剪接位點的新型CRISPR文庫，以高通量的方式產生基因的外顯子缺失或者內含子滯留。運用這一策略，實現(xiàn)了全基因組水平上對lncRNA功能的高效篩選，篩選并發(fā)現(xiàn)了230個lncRNA與細胞存活或增殖相關。并通過進一步分析表明，lncRNA功能在不同細胞種類中具有顯著異質性。這一新型高通量技術平臺的建立，首次真正實現(xiàn)了從全基因組水平對長鏈非編碼RNA進行基于完全敲除的高通量篩選，該方法學將為系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和解析lncRNA功能提供有效工具[9]。
10. SLICE：一種利用Cas9蛋白電穿孔進行單向導RNA慢病毒感染的系統(tǒng)
2018年11月，來自美國加州大學舊金山分校的研究人員在Cell期刊發(fā)文，提出一種基于CRISPR的篩選工具-SLICE，一種利用Cas9蛋白電穿孔進行單向導RNA慢病毒感染的系統(tǒng)。基于sgRNA慢病毒文庫的傳統(tǒng)CRISPR篩選技術因慢病毒載體編碼Cas9蛋白時間太長對于體外培養(yǎng)時間有限的原代T細胞來說受到限制，而SLICE系統(tǒng)將通過將sgRNA慢病毒文庫與Cas9蛋白電穿孔相結合的方式，能夠快速導入患者的原代T細胞中并評估各個基因的功能。這種新方法能夠為免疫細胞抗癌的改造以及其他疾病的指導提供強有力的依據(jù)[10]。
二、DNA標記與細胞譜系示蹤
發(fā)育生物學的重點包括構成器官或生物體的細胞類型的多樣性以及這些細胞的發(fā)育譜系歷史。這些方面通常作為一個方向被單獨研究，但最近的四篇新論文報道了一種將單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術與基于CRISPR的譜系示蹤技術相結合來同時解剖轉錄組細胞表型和譜系歷史的方法。近些年來CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)已被證明可用于細胞譜系示蹤[11]。在經典的實驗方案中，條形碼陣列被設計到生物體的基因組中；在胚胎發(fā)育的早期階段，胚胎共注射Cas9和導向RNA（gRNA）靶向切割條形碼陣列。在CRISPR編輯期間，條形碼在不同細胞中以可變的方式被累積切割和修復。隨后在特定的發(fā)育時間點對條形碼序列進行分析，就可以從已有的Cas9誘導的突變類型中推斷出細胞之間的譜系關系。
1. 三項標志性研究通過利用scRNA-seq提供的細胞類型信息來研究斑馬魚的發(fā)育過程，展示CRISPR系統(tǒng)在細胞譜系示蹤中的可行性
l Alemany等人開發(fā)了一種被稱為ScarTrace的方法，這一方法是在Cas9 蛋白或RNA同靶向GFP的gRNA一起注射胚胎后，靶向八個串聯(lián)拷貝的GFP基因的轉基因基因組簇。對分化后的組織進行scRNA-seq分析，該團隊使用一種分選和自動化輔助的轉錄組測序（SORT-seq）方案。盡管Cas9編輯的GFP序列（'傷疤'）通常在細胞中表達，因此可以從轉錄組中讀出，但SORT-seq結合了巢式PCR步驟，從單個細胞中的剩余基因組DNA中讀出瘢痕序列，從而最大程度地減少缺乏GFP表達的細胞的譜系信息的丟失。研究人員分析了各種組織的克隆歷史 - 包括造血系統(tǒng)，成體大腦和眼睛以及再生鰭 - 以提供各種發(fā)育信息，例如作為特定分化細胞亞群前體的祖細胞的數(shù)量和類型[12]。
l Spanjaard等人則報告了一種概念上同前者類似的譜系追蹤方法，通過核酸酶激活來編輯普遍存在的序列（LINNAEUS），讓人們能夠確定細胞類型和細胞譜系。該方法涉及胚胎注射Cas9蛋白和靶向16-32個遍布基因組的紅色熒光蛋白（RFP）基因的整合位點的gRNA。使用基因組分散的靶序列的基本原理是避免附近的陣列拷貝之間的刪除，這可能會刪除它們之間的含大量信息的拷貝。LINNAEUS適用于斑馬魚幼體，以及成體心臟，肝臟，胰腺和大腦。該團隊使用基于液滴的微流體進行scRNA-seq，突變的RFP序列從轉錄組中讀出，并被分成一個用于轉錄組范圍分析的文庫和一個靶向分析RFP序列的文庫。除了實驗過程，Spanjaard等人突出了生物信息學的挑戰(zhàn)和對定制分析方法的需求，因為物種進化研究得出的標準系統(tǒng)發(fā)育算法對細胞譜系重建來說并不是最理想的，主要是由于需要大量（數(shù)萬）的單細胞比較和譜系條碼不能完整的檢測出來[13]。
l 第三項研究中，Raj等人著重探索如何克服胚胎注射Cas9僅在發(fā)育的最初幾個小時內有效的限制。因此，除了胚胎注射Cas9蛋白和4個靶向RFP條形碼的1-4位點的gRNA之外，斑馬魚還同時轉基因編碼Cas9和另外5個靶向RFP條形碼5-9位點的gRNA，這些gRNA均可通過熱誘導在特定的時間表達來監(jiān)測后期發(fā)育的階段。這一方法被稱為scGESTALT（一種基于之前報道的GESTALT示蹤方法的單細胞衍生技術），scRNA-seq同Spanjaard等人類似，使用基于液滴的微流體技術和轉錄組的靶向富集來測序條形碼。 Raj等人的分析主要集中在大腦上，確定了神經細胞類型之間的許多譜系關系以及發(fā)育轉變期間可能的基因表達關系[14]。這些強大的細胞示蹤技術可用于研究各種正常和病理的發(fā)育現(xiàn)象，還可用于其他模式生物。
2. “創(chuàng)始小鼠（founder mouse）”為CRISPR系統(tǒng)在哺乳動物細胞中進行細胞譜系示蹤創(chuàng)造可能
上述研究在細胞和低等脊椎動物中證實了CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)在細胞譜系示蹤中應用的可行性。然而，目前還沒有在老鼠身上進行驗證，老鼠是一種在許多方面（如發(fā)育方面）與人類健康更相關的模式生物。小鼠發(fā)育過程較長，以及在其整個發(fā)育過程中分化成眾多譜系，因而需要持續(xù)生成高度多樣化的條形碼，最大限度地減少不必要的重寫事件，以最大限度地提高成功記錄重要事件的幾率。
在一項新的研究中，來自哈佛大學George Church課題組通過構建了一種含有多個獨立的條形碼位點分散陣列（hgRNAs）的“創(chuàng)始小鼠”，將創(chuàng)始小鼠與表達Cas9蛋白的小鼠雜交，子代小鼠因為hgRNA會在整個妊娠期隨機累積突變，在每個譜系中產生獨特的突變，并且不會刪除早期的突變，使得相關的細胞具有更加相似的突變譜或條形碼。在發(fā)育條形碼小鼠中，廣泛表征每種hgRNA的活性譜和突變等位基因，并在發(fā)育早期對譜系樹進行自下而上的后期重建，從其根部的第一個分支開始，并追蹤細胞的原始譜系。這一研究為哺乳動物模型中的體內條形碼和譜系追蹤提供了一個可行的通用平臺系統(tǒng)[15]。
三、基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的疾病診斷技術
快速分子診斷技術在許多領域非常有用，包括公共衛(wèi)生、環(huán)境檢測和刑事偵查等�；贑RISPR開發(fā)的體外診斷技術入選2018年世界十大科技進展。CRISPR-Cas系統(tǒng)現(xiàn)已被證明可特異性地識別并切割DNA和RNA，這暗示了該系統(tǒng)作為通用核酸識別工具的潛在用途。由于靶序列和CRISPR-Cas系統(tǒng)之間識別的特異性，CRISPR-Cas系統(tǒng)已被用于檢測點突變或單核苷酸變體。這項技術能夠通過分析病原體的DNA或RNA來檢測感染過程中的病原體。下面列舉了今年以來CRISPR-Cas系統(tǒng)在分子診斷方面取得的重大突破（如下圖所示）。
1. 基于Cas13的分子檢測系統(tǒng)
自2017年張鋒團隊利用Cas13a (以前稱為C2c2 ) 在靶識別時表現(xiàn)出混雜核糖核酸酶活性的“附帶效應”與等溫擴增相結合，建立了基于CRISPR的診斷方法( CRISPR-Dx )，一種具有同向敏感性和單堿基錯配特異性的快速DNA或RNA檢測技術---SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）診斷平臺，可用于檢測寨卡病毒和登革病毒、細菌分離物、抗生素抗性基因、人類DNA基因型和癌癥突變等[17]。之后不久，該團隊對SHERLOCK診斷平臺進行一系列優(yōu)化，成功開發(fā)了SHERLOCKv2系統(tǒng)，該系統(tǒng)集成了四種正交的CRISPR-Cas酶，是目前唯一可以實現(xiàn)同時檢測多個靶向位點的檢測系統(tǒng)，突出其多向、便攜、快速和定量核酸檢測平臺的潛力[18]。同時，他們也進一步開發(fā)了HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）系統(tǒng)，與SHERLOCK相輔相成，用于直接從體液中檢測病毒，能夠在不用任何儀器的情況下在不到2小時內直接從患者樣品中進行檢測，極大地提高了分子檢測的便利性[19]。
2. 基于Cas12的分子檢測系統(tǒng)
l Jennifer A. Doudna團隊也通過將Cas12a (CpfI)與分子信號槍相結合實現(xiàn)了靈敏而又準確的DNA檢測。這種方法被稱作DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）。這一方法的基礎在于發(fā)現(xiàn)Cas12a在靶向到DNA靶標后具有切割附近所有單鏈DNA的功能，開發(fā)人員利用一種熒光分子通過單鏈DNA與另一種抑制這一熒光分子發(fā)光的抑制分子連接在一起。在Cas12a切割單鏈DNA后將會移除一直分子，從而讓這一熒光分子發(fā)光。利用這一技術，他們成功對致癌性HPV病人樣品進行了正確的判斷[20]。同時我國王金課題組在3月12日的Cell Research雜志上也發(fā)表了題為CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA的研究論文，同前期Jennifer Doudna課題組發(fā)表的的研究結果類似，系統(tǒng)地研究了Cas12a對于靶標ssDNA和非靶標ssDNA的切割特性[21]。
l 此外，上海吐露港的研究團隊在2017年基于對側鏈單鏈DNA具有反式切割活性的Cas12a開發(fā)的一種高效、靈敏和特異的檢測DNA、RNA病毒和人的SNP的平臺HOLMES (one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System)[22]。隨后于2018年年底，該團隊將同樣具有ssDNA反式切割活性的嗜熱性Cas12b與LAMP介導的等溫擴增( LAMP )相結合，創(chuàng)建了改進版的HOLMESv2。在HOLMESv2中，LAMP擴增和Cas12b反式切割可以整合到一個恒溫的一步系統(tǒng)中，因此為核酸檢測帶來了極大的便利。同時他們還簡化了HOLMESv2中的RNA檢測程序，使用RNA依賴性DNA聚合酶進行擴增，因此省略了額外的逆轉錄步驟，這是迄今為止最簡單的用于RNA檢測的CRISPR生物傳感系統(tǒng)[23]。
小結：
綜上為大家介紹了CRISPR/Cas9在2018年重大機制進展和諸多方面的應用，可以看到基礎科學家已經在利用CRISPR-Cas9技術理解和操縱生物學方面取得了巨大進展，在臨床上，我們可以期待基因疾病的新療法（如利用Cas9基因編輯或CRISPRi/a）和新的診斷技術。我們能夠利用大自然的技術工具箱，通過進化改造更多高效且安全的基因編輯工具為我們所用。新的CRISPR系統(tǒng)或許就隱藏在我們周圍生物體的基因組中，未來可能會出現(xiàn)更多具有新的機制和功能的CRISPR衍生物，將會為人類提供強大的突破性技術。
參考文獻：
[1] Bester, Assaf C., et al. "An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance." Cell173.3(2018):649-664.e20.
[2] Sadhu, M. J., et al. "Highly parallel genome variant engineering with CRISPR-Cas9. " Nature Genetics50.4(2017):510.
[3] Guo, Xiaoge, et al. "High-throughput creation and functional profiling of DNA sequence variant libraries using CRISPR–Cas9 in yeast." Nature Biotechnology (2018).
[4] Bao, Zehua, et al. "Genome-scale engineering of Saccharomyces cerevisiae with single-nucleotide precision." Nature Biotechnology (2018).
[5] Roy, K. R., et al. "Multiplexed precision genome editing with trackable genomic barcodes in yeast." Nature Biotechnology (2018).
[6] Horlbeck, Max A., et al. "Mapping the Genetic Landscape of Human Cells." Cell (2018): S0092867418307359-.
[7] Halperin, Shakked O., et al. "CRISPR-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window." Nature (2018).
[8] Wroblewska, A, et al. "Protein Barcodes Enable High-Dimensional Single-Cell CRISPR Screens." Cell175.4(2018):1141.
[9] Liu, Ying, et al. "Genome-wide screening for functional long noncoding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites." Nature Biotechnology (2018).
[10] Shifrut E, et al. Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Cell. 2018 Dec 13;175(7): 1958-1971.e15.
[11] Kalhor, Reza, P. Mali, and G. M. Church. "Rapidly evolving homing CRISPR barcodes." Nature Methods 14.2(2016):195-200.
[12] Alemany, A. et al. Whole-organism clone tracing using single-cell sequencing. Nature 556, 108–112 (2018)
[13] Spanjaard, Bastiaan, et al. "Simultaneous lineage tracing and cell-type identification using CRISPR–Cas9-induced genetic scars." Nature Biotechnology (2018).
[14] Raj, Bushra, et al. "Simultaneous single-cell profiling of lineages and cell types in the vertebrate brain." Nature Biotechnology (2018).
[15] Reza, Kalhor, et al. "Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR." Science (2018): eaat9804-.
[16] YiLi et al., CRISPR/Cas Systems towards Next-Generation Biosensing. Trends Biotechnol (2018).
[17] Gootenberg, Jonathan S., et al. "Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2." Science 356. 6336 (2017):438-442.
[18] Myhrvold, Cameron, et al. "Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13." Science 360.6387(2018):444-448.
[19] Gootenberg, Jonathan S., et al. "Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6." Science 360.6387(2018):eaaq0179.
[20] Chen, Janice S. , et al. "CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity." Science (2018):eaar6245.
[21] Li, Shi Yuan, et al. "CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA." Cell Research (2018).
[22] Cheng, Q.X. et al. Shanghai Tolo Biotech Co.,Ltd. An application of a Cas protein, and a method and kit for detecting a target nucleic acid molecule, (2017) CN107488710A
[23] L. Li, S. Li, J. Wang, CRISPR-Cas12b-assisted nucleic acid detection platform. bioRxiv, (2018).
