基因編輯進展梳理 Part II 基于CRISPR-Cas9的技術(shù)應(yīng)用篇(上)

前言：近年來，CRISPR基因編輯技術(shù)正在席卷整個生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，上一期我們已先從CRISPR系統(tǒng)開發(fā)及機制研究方面梳理了2018年相關(guān)大事件。伴隨著基礎(chǔ)技術(shù)不斷優(yōu)化，CRISPR技術(shù)的應(yīng)用也更加廣泛，如動物造模、藥物篩選、單堿基編輯技術(shù)、細胞譜系示蹤、基礎(chǔ)疾病研究、疾病診斷、體內(nèi)編輯和遺傳病校正等方面。值得一提的是，全球首例基于CRISPR的基因編輯臨床試驗已于2018年開始實施[1]，同年12月，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)Editas的一項利用CRISPR技術(shù)治療先天性黑朦病的臨床試驗申請，有望成為世界上第一種在人體內(nèi)使用CRISPR技術(shù)的療法。本期小編就先從動物造模及單堿基技術(shù)等方面帶大家瀏覽一下近一年里CRISPR技術(shù)應(yīng)用的重大突破。



CRISPR技術(shù)的五大應(yīng)用領(lǐng)域

一、大動物造模
CRISPR-Cas9系統(tǒng)以其簡易的操作為動物模型的構(gòu)建提供了高效的方法。目前基于CRISPR-Cas9構(gòu)建的各種人類疾病的動物模型數(shù)以千計，主要以嚙齒類動物（如小鼠）模型為主，其相關(guān)的發(fā)病機制和治療進展為臨床應(yīng)用提供了許多有價值的參考。邦耀實驗室也一直致力于相關(guān)研究，在國際知名期刊上發(fā)表多篇關(guān)于基因編輯大小鼠構(gòu)建及其在多種疾病上應(yīng)用的文章，并為廣大的科研用戶提供了數(shù)百種基因編輯動物模型。
盡管小鼠模型可以很好地展示疾病的表征，但由于壽命和生理構(gòu)造等方面的巨大差異，對于許多神經(jīng)退行性疾病以及同年齡相關(guān)等的疾病，并不能很好地模擬許多人類疾病的相應(yīng)表征。因此，在遺傳學(xué)、解剖學(xué)和生理學(xué)上與人類更接近的大型哺乳動物模型的構(gòu)建顯得尤為重要。由于胚胎干細胞技術(shù)較難、繁殖周期太長和基因編輯效率低等障礙，大型哺乳動物模型的構(gòu)建一直都是科技攻關(guān)的難點。
然而，隨著CRISPR-Cas9技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)有的基因編輯工具已被證明能夠成功構(gòu)建各類大型哺乳動物模型。2018年中國科學(xué)家在基因編輯豬和猴上做出了重要貢獻，在基于CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建基因編輯大型哺乳動物模型方面引領(lǐng)了世界的腳步。
1. “基因敲入”豬：亨廷頓舞蹈病豬模型的構(gòu)建
2018年3月，來自中國的多個團隊合作建立了一個“基因敲入”的亨廷頓舞蹈癥（HD）豬模型，利用CRISPR-Cas9技術(shù)將導(dǎo)致HD的mHTT基因片段整合入豬成纖維細胞中，再通過體細胞核移植技術(shù)獲得mHTT轉(zhuǎn)基因豬模型，這一研究為測試HD療法提供了一種重要的動物模型[2]。
2. 六篇文章奠定了我國科學(xué)家在構(gòu)建基因編輯猴模型中的世界領(lǐng)先地位
l 2018年年初，中科院神經(jīng)科學(xué)研究所的研究人員首次報道了，通過在胚胎細胞分化為特殊細胞時去除DNA上的化學(xué)修飾的方式，成功克服了非人靈長類動物的體細胞克隆的限制，首次實現(xiàn)了基因克隆猴的誕生（見圖1a），標(biāo)志著非靈長類動物體細胞克隆技術(shù)的里程碑[3]。
l 一年后，該課題組又相繼發(fā)表兩篇文章，通過CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了睡眠紊亂與精神相關(guān)異常的BMAL1敲除猴[4]，隨后將BMAL1敲除猴的皮膚成纖維細胞作為細胞核供體通過體細胞核移植的方法獲得了遺傳背景一致的疾病敲除猴模型（見圖1b）[5]，為非靈長類動物疾病模型的構(gòu)建及在臨床研究中的應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。



l 2018年1月12日，Cell Research雜志同時發(fā)表了兩篇來自中國科學(xué)家的研究工作，報道了世界首例基因敲入食蟹猴的誕生。其中來自中科院神經(jīng)科學(xué)研究所的楊輝研究組利用之前開發(fā)的一種同源末端介導(dǎo)整合(HMEJ)的方法，以胚胎原核注射方式通過優(yōu)化注射條件首次成功獲得了ACTb-T2A-mcherry基因定點敲入食蟹猴（見圖2），并證實這些猴子具有生殖遺傳的可能。這一研究為通過提高整合效率來構(gòu)建基因敲入猴提供了新的解決思路[6]。



另一項研究則由早年利用CRISPR技術(shù)成功構(gòu)建基因敲除食蟹猴的季維智院士團隊合作完成，他們基于之前利用CRISPR-Cas9在大鼠上進行精確基因編輯的技術(shù)進一步拓展到食蟹猴中，成功獲得了Oct4最后一個密碼子后定點整合GFP的食蟹猴，并檢測到少許的錯配以及脫靶現(xiàn)象。這項研究證明了靈長類動物可成功進行精確基因編輯的可行性，為靈長類動物的重編程研究提供了一種通用的工具[7]。
l 2018年8月23日，中國科學(xué)院干細胞與再生創(chuàng)新研究院的研究團隊在Nature發(fā)文，首次實現(xiàn)了在非人靈長類動物中全身敲除SIRT6，獲得了世界上首例特定長壽基因敲除的食蟹猴模型（見圖3），確定了SIRT6在非靈長類動物中的生物學(xué)功能。研究的結(jié)果表明，SIRT6參與調(diào)節(jié)非人靈長類動物的發(fā)育，SIRT6的缺乏會導(dǎo)致胎兒在子宮內(nèi)發(fā)育延遲。這一模型的建立可能為模擬和研究人圍產(chǎn)期致死綜合征的發(fā)病機制開辟了新的途徑[8]。



二、單堿基基因編輯技術(shù)的優(yōu)化
單堿基基因編輯技術(shù)是指能在基因組上引起單個堿基改變的基因編輯技術(shù)�；�本原理是將胞嘧啶脫氨酶（APOBEC）或腺苷脫氨酶與現(xiàn)存Cas9n(D10A)融合而形成，依賴于CRISPR原理使得靶點遠離PAM端的4-7位的單個堿基發(fā)生修改的基因編輯技術(shù)。單堿基編輯系統(tǒng)以其不用切割基因組就能實現(xiàn)堿基的置換而被作為目前最為安全有效的基因編輯工具，但其編輯范圍、編輯窗口、編輯效率以及特異性等未完善的問題仍然需要進一步地改造和優(yōu)化。
1. xCas9: Cas9快速進化系統(tǒng)擴大堿基編輯工具靶向范圍
2018年2月，David  Liu 實驗室在Nature發(fā)文，使用噬菌體輔助的連續(xù)進化系統(tǒng)進化Cas9從而獲得了一種能識別多種PAM的SpCas9變體( xCas9 )，它可以識別包括NG、GAA和GAT在內(nèi)的多種PAM序列，可以靶向人類基因組范圍內(nèi)約1/4的靶點。xCas9支持在人類細胞中的多種應(yīng)用，包括靶向轉(zhuǎn)錄激活、核酸酶介導(dǎo)的基因敲除以及胞苷和腺嘌呤堿基編輯。相比spCas9，xCas9具有更高的DNA特異性，且當(dāng)用非NGG PAMs靶向基因組位點時，xCas9也表現(xiàn)出極低的非靶向活性。這些發(fā)現(xiàn)擴大了CRISPR系統(tǒng)的DNA靶向范圍，與ABEs 融合，也同樣使ABEs PAM的選擇更加靈活[9]。
2. dCpf1-BEs：一種能夠識別富含T的PAM的堿基編輯器
2018年5月，上�？萍即髮W(xué)陳佳實驗室在Nature Biotechnology發(fā)文，通過將大鼠胞嘧啶脫氨酶APOBEC1融合到催化失活的Cpf1中，開發(fā)了一種基于CRISPR-Cpf1的dCpf1-BEs，從而克服了目前BEs僅能靶向富含G/C的PAM序列的限制，使之能夠識別富含T的PAM序列，并催化人體細胞中的C - T轉(zhuǎn)換，同時產(chǎn)生較低的編輯副產(chǎn)物，具有更高的編輯精度。這些發(fā)現(xiàn)為堿基編輯系統(tǒng)的全面深入應(yīng)用提供了新思路、拓展了應(yīng)用范疇[10]。



3. BE4max 和ABEmax：優(yōu)化堿基編輯器解決表達水平的技術(shù)瓶頸
2018年5月，David Liu實驗室在Nature biotechnology繼續(xù)發(fā)文，認為表達水平是堿基編輯器的技術(shù)瓶頸，通過引入核定位信號( NLS )和密碼子優(yōu)化，以及脫氨酶組分的原始重建，優(yōu)化胞苷( BE4 )和腺嘌呤( ABE7.10 )堿基編輯器，獲得了編輯效率更高的BE4max 和ABEmax，分別提高1.9倍和1.3-7.9倍。優(yōu)化的堿基編輯器可校正致病性SNPs，大大提高了在各種哺乳動物細胞中的編輯效率[11]。
4. BE-PLUS：新型堿基編輯工具具有更寬的編輯窗口和更高的保真度
2018年 7月，陸軍軍醫(yī)大學(xué)陳潔平課題組和上�？萍即髮W(xué)黃行許課題組合作在Cell Research上發(fā)文，開發(fā)了一種新的編輯技術(shù)BE-PLUS，將10個拷貝的GCN4肽融合到nCas9 ( D10A )中，向靶位點招募scFv - APOBEC - UGI - GB1，從而更大范圍地進行C to U ( T )的編輯，極大地拓展了堿基編輯器的編輯窗口。新系統(tǒng)通過擴大窗口實現(xiàn)了堿基編輯，從而擴大了基因組的靶向范圍，并且還能提高保真度[12]。



5. 優(yōu)化堿基編輯器實現(xiàn)細胞、類器官和小鼠中的高效編輯
2018年7月，Nature biotechnology刊登了一篇新的研究，通過密碼子優(yōu)化和加入額外的核定位序列，重新設(shè)計BE3、BE4Gam和xBE3的序列。優(yōu)化篩選的組成型和誘導(dǎo)型堿基編輯系統(tǒng)極大地提高了C to T的突變效率，重新設(shè)計的堿基編輯器還能在多種小鼠和人類細胞系以及腸道器官中進行目標(biāo)修飾，該研究還在成年小鼠肝臟中成功介導(dǎo)了有效的體內(nèi)細胞編輯。這些優(yōu)化有助于單堿基編輯工具更加高效靈活的應(yīng)用[13]。
6. eA3A-BE3：工程化人源APOBEC3A減少目標(biāo)位點的周邊突變
2018年 7月，哈佛大學(xué)和麻省總醫(yī)院的J. Keith Joung課題組在Nature biotechnology發(fā)文，通過使用一種工程化的人APOBEC3A (eA3A )結(jié)構(gòu)域來減少基于CRISPR - Cas9的胞苷脫氨酶周邊突變的策略，該結(jié)構(gòu)域根據(jù)一種TCR>TCY>VCN的優(yōu)先等級來對特定基序中的胞苷進行去氨基化，極大地降低了普遍存在的五堿基對編輯窗口中存在不止一個C時，現(xiàn)有的堿基編輯器會產(chǎn)生不必要的C到 T轉(zhuǎn)換的可能。eA3A-BE3比BE3顯示更高的精度（超過40倍）以及更低的脫靶效率，且保持相似的編輯活性。利用這一系統(tǒng)他們還高效校正了人β-地中海貧血啟動子的突變，為堿基編輯的臨床運用提供了更高精度的編輯工具[14]。


7. hA3A-BE3:：人APOBEC3A實現(xiàn)高甲基化區(qū)域C to T的高效編輯
2018年8月，來自上�？萍即髮W(xué)和中科院的研究人員在Nature biotechnology發(fā)文，通過篩選多種APOBEC和 AID脫氨酶，發(fā)現(xiàn)人類APOBEC3A結(jié)合BEs的系統(tǒng)具有更窄的編輯窗口可以在甲基化水平和GpC二核苷酸含量高的區(qū)域高效介導(dǎo)C到T的堿基編輯，解決了目前基于大鼠APOBEC1的BEs 系統(tǒng)在編輯高度甲基化的胞嘧啶時效率相對較低的問題[15]。



8. 同期兩篇報道首次利用ABEs系統(tǒng)實現(xiàn)老鼠疾病模型的構(gòu)建
2018年9月，Protein & Cell期刊刊登了兩篇利用優(yōu)化改良腺嘌呤堿基編輯器（ABE）分別在小鼠和大鼠中進行高效的堿基編輯。文中不僅強調(diào)了ABEs在誘導(dǎo)A - T轉(zhuǎn)化為G - C過程中的保真度和效率，還展示了它們在產(chǎn)生疾病模型以及糾正動物和人類胚胎中的疾病突變方面的潛在易用性和多功能性。具體如下：
l 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院院長、邦耀生物首席科學(xué)家劉明耀教授及團隊成員李大力教授課題組，使用優(yōu)化的ABE系統(tǒng)有效地創(chuàng)建了三種小鼠品系，成功構(gòu)建了遺傳性肌肉變性疾�。―MD）的小鼠模型。另外同時構(gòu)建了II型遺傳性糖原貯積病（GSD）的大鼠模型。這是第一個通過堿基編輯系統(tǒng)在老鼠上實現(xiàn)高效點突變的報道。該研究不僅在疾病模型的構(gòu)建方面有很大的潛力，更重要的是在治療由點突變引起的遺傳性疾病方面具有重要應(yīng)用價值[16]。
l 中山大學(xué)黃軍就和松陽洲團隊同樣適用ABEs系統(tǒng)測試了在疾病小鼠模型構(gòu)建中的有效性。通過ABE來靶向mRNA剪接位點以誘導(dǎo)基因功能障礙的策略成功構(gòu)建了小鼠白化病和DMD模型。這些結(jié)果表明ABEs可以有效和精確地將小鼠胚胎中的堿基A轉(zhuǎn)化為G，證明這是一種產(chǎn)生點突變小鼠模型的高保真工具[17]。
9. A3A-PBE：利用nCas9和人類APOBEC3A的融合，在植物中進行高效的C to T編輯
2018年10月，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組在Nature Biotechnology上發(fā)文，展示了一種由Cas9 nickase和人APOBEC3A （A3A-PBE）組成的堿基編輯系統(tǒng)（A3A-PBE）在小麥、水稻和馬鈴薯中高效地C到T的堿基編輯。同時將尿嘧啶糖基化酶抑制劑 (UGI)和MU融合到A3A-PBE，創(chuàng)建了A3A-Gam系統(tǒng)，極大地提高了堿基編輯效率。新系統(tǒng)不僅將基于大鼠APOBEC1的BE3僅限5 nt序列編輯窗口擴大到了17nt，而且還能有效地編輯GC含量高的區(qū)域，對于新品種培育和作物遺傳改良具有重要的應(yīng)用價值[18]。



小結(jié)
綜上，為大家簡單介紹了2018年CRISPR系統(tǒng)在大動物模型構(gòu)建和單堿基編輯技術(shù)上的重大突破。展望未來，我們可以預(yù)見CRISPR-Cas9技術(shù)將會給基礎(chǔ)科研和臨床研究帶來的突飛猛進的發(fā)展。盡管現(xiàn)階段還沒有充分開發(fā)，但這項技術(shù)已經(jīng)在生物以及醫(yī)療研究中帶來了革命性的變革，包括基因組編輯、基因篩選和細胞示蹤，疾病治療等等。關(guān)于更多重大應(yīng)用我們下期繼續(xù)介紹！

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