基因編輯進(jìn)展梳理 Part I CRISPR系統(tǒng)拓展及機(jī)制研究篇

基因編輯技術(shù)是指對目標(biāo)基因進(jìn)行編輯，實(shí)現(xiàn)對特定DNA片段的敲除、插入等。自CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)問世以來，取得了一系列重大突破，并相繼在2012、2013、2015和2017年被Science雜志評為十大科學(xué)進(jìn)展之一。因此，CRISPR/Cas9以其操作簡便和成本低廉等優(yōu)勢受到了眾多研究者和投資者的青睞。

如下圖所示：從2011到2018年，NIH對CRISPR相關(guān)研究的資助從500多萬美元快速增長到11億美元，而且CRISPR相關(guān)科學(xué)出版物的數(shù)量也從最初的87篇急劇增長到3917篇，這些數(shù)據(jù)反映了CRISPR /Cas9的巨大潛在價(jià)值。


2018年，CRISPR系統(tǒng)繼續(xù)發(fā)力，在多個(gè)領(lǐng)域取得突破性的進(jìn)展，本期我們就先從CRISPR系統(tǒng)開發(fā)及機(jī)制研究方面來梳理一下相關(guān)的重大事件。

一、新型CRISPR系統(tǒng)繼續(xù)拓展基因組編輯范圍
自2013年最早公布的spCas9以來[1]，科學(xué)家一直致力于在復(fù)雜的細(xì)菌群體中尋找更多Cas9的同系物來拓展基因編輯工具文庫，以克服現(xiàn)有Cas9系統(tǒng)存在的諸多問題，比如組分太大無法包裝入AAV（腺相關(guān)病毒載體）、PAM無法覆蓋整個(gè)基因組等等。隨著saCas9，Cpf1和Cas13等相繼問世（如圖），新型基因編輯系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)除了編輯DNA，逐漸開始具有編輯RNA以及單雙鏈核苷酸等更多功能，這些新系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)不僅拓展了CRISPR的編輯范圍，還延伸了其在諸多領(lǐng)域中的應(yīng)用。2018年，又有更多有潛力的CRISPR系統(tǒng)相繼被科學(xué)家們鑒定并改造。

1. CasRx：更強(qiáng)版本的Cas13系統(tǒng)
2017年底張鋒團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)Cas13系統(tǒng)，確認(rèn)了其可以靶向哺乳動物細(xì)胞中的RNA[2]。
2018年3月15日，Salk研究所的Konermann等人為Cas13家族再添一名新成員：Cas13d。這是一種來自腸道細(xì)菌（黃化瘤胃球菌XPD3002）的CRISPR/Cas系統(tǒng)，被命名為CasRx。同Cas13類似，CasRx能夠特異性的靶向并切割RNA，但比其他Cas13分子量小20%。同時(shí)CasRx介導(dǎo)的敲低效果相對于其他RNA調(diào)控方法具有更高的效率和特異性[3]。

2. 環(huán)狀核酸酶（ring nuclease）：病毒防御狀態(tài)的終止“開關(guān)”
III型效應(yīng)復(fù)合物最近被證明可結(jié)合入侵病毒的遺傳物質(zhì)形成一種環(huán)狀寡腺苷酸，俗稱第二信使，這一分子會通過CRISPR相關(guān)的Rossman折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合并激活核糖核酸酶和其他因子來抵抗病毒的入侵，使細(xì)胞進(jìn)入抗病毒狀態(tài)。然而這種狀態(tài)的持續(xù)激活對細(xì)胞是不利的，研究人員推測可能存在某種機(jī)制，在病毒被清除后關(guān)閉這種狀態(tài)。2018年9月19日，Malcolm White團(tuán)隊(duì)證實(shí)了這一機(jī)制，一種被稱為環(huán)狀核酸酶的蛋白可特異性地切割環(huán)裝寡腺苷酸，從而終止抗病毒狀態(tài)。環(huán)狀核酸酶的鑒定增加了人們對CRISPR系統(tǒng)的理解 [4]。

3. Cas14: 目前最小型Cas蛋白，為疾病診斷又添一利器
2018年10月18日，Jenifer Doudna團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了迄今為止最小的功能性CRISPR系統(tǒng)---Cas14上。Cas14只有400-700個(gè)氨基酸，但它同Cas12和Cas13一樣，能夠靶向切割單鏈DNA ( ssDNA )，且沒有限制性序列要求，因而會盲目地切割細(xì)胞內(nèi)所有的ssDNA。這一特性使得高保真單核苷酸多態(tài)性基因分型成為可能。通過進(jìn)一步的改進(jìn)，可以為目前已有的診斷系統(tǒng)（DETECTR）提供更多的選擇[5]。

4. Cas12蛋白新組員，進(jìn)一步拓展CRISPR系統(tǒng)的工具箱
Cas12a（Cpf1）同SpCas9已被作為最為常用的CRISPR-Cas基因編輯工具，并成功應(yīng)用于基因組工程的各個(gè)領(lǐng)域。相比SpCas9，Cas12a以其較小的體積（1228bp）和僅需單個(gè)RNA的引導(dǎo)等優(yōu)勢被廣泛研究和使用[6]。2018年12月6日來自美國Arbor Biotechnologies的研究人員發(fā)現(xiàn)了一組新的Cas12蛋白成員：Cas12c、Cas12g、Cas12h和Cas12i。其中的Cas12c、Cas12h和Cas12i具有RNA導(dǎo)向的雙鏈DNA切割活性，還發(fā)現(xiàn)Cas12i在CRISPR的crRNA間隔區(qū)的互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈上表現(xiàn)出明顯的切割效率差異，這導(dǎo)致dsDNA形成的主要是單鏈切口（nicking）。Cas12g則主要以核糖核酸酶的形式，通過RNA靶向切割單鏈RNA和單鏈DNA。這項(xiàng)研究揭示了V型CRISPR-Cas系統(tǒng)在不同路線進(jìn)化中的功能多樣性，同時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)展了CRISPR工具箱的運(yùn)用范疇[7]。

二、工程化CRISPR系統(tǒng)拓展基因組應(yīng)用范圍
盡管CRISPR-Cas9系統(tǒng)被廣泛用于基因組編輯，但Cas9可以識別的序列范圍受到特定原間隔基相鄰基序( PAM)需求的限制，因此通常很難實(shí)現(xiàn)高精度靶向雙鏈DNA斷裂的基因組編輯應(yīng)用，這包括目前熱門的單堿基編輯和基于CRISPR的基因篩選等技術(shù)。隨著Cas9蛋白組學(xué)的深入研究，通過人為引入隨機(jī)突變來改變PAM特異性的Cas9衍生物使突破這一限制成為可能。目前，科學(xué)家主要通過結(jié)構(gòu)信息、基于定向進(jìn)化的細(xì)菌選擇系統(tǒng)來識別不同PAM序列的Cas9功能突變體，這些Cas9突變體具有與野生型SpCas9相當(dāng)?shù)木庉嬆芰�和特異性。這一技術(shù)為尋找高精度的Cas9突變體提供了研究方向，極大地拓展了CRISPR系統(tǒng)工具包，為實(shí)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)全基因組編輯打開了大門[8]。

1. 建立新型細(xì)菌防御系統(tǒng)篩選系統(tǒng)，開發(fā)更多具有潛在價(jià)值的分子工具
2018年1月25日，來自以色列魏茨曼科學(xué)研究所的Rotem Sorek團(tuán)隊(duì)在Science上發(fā)文，通過構(gòu)建出一種掃描所有細(xì)菌基因組的計(jì)算機(jī)程序來研究更多的防御系統(tǒng)基因，將合成的多基因系統(tǒng)插入到天然免疫系統(tǒng)已被滅活的細(xì)菌中，通過噬菌體和其他感染因子的篩選，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌存在10種之前未知的細(xì)菌免疫防御機(jī)制。這些新型防御系統(tǒng)中的任何一種都有可能成為下一種基因編輯工具 [9]。

2. xCas9: 一種能夠識別多種PAM序列的SpCas9突變體
2018年2月28日，David Liu團(tuán)隊(duì)在Nature期刊上發(fā)文，他們利用一種噬菌體輔助的連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng) ( PACE ) 進(jìn)化出一種能夠識別多種PAM序列的SpCas9變體( xCas9 )。xCas9的PAM相容性是迄今為止在所有Cas9識別范圍的哺乳動物中最為廣泛的，并可以應(yīng)用于人類細(xì)胞中，包括靶向轉(zhuǎn)錄激活、核酸酶介導(dǎo)的基因敲除，單堿基編輯等。值得注意的是，盡管xCas9的PAM兼容性有所擴(kuò)大，但它的DNA特異性要比SpCas9高得多，在NGG PAMs和非NGG PAMs靶位點(diǎn)中全基因組的脫靶效應(yīng)也都比spCas9低得多。其中最佳的xCas9 PAMs為NGN，占約四分之一的人類基因組。xCas9的出現(xiàn)極大地?cái)U(kuò)展了CRISPR系統(tǒng)的DNA靶向范圍，使CRISPR系統(tǒng)變得更加精確和靈活[10]。
3. SpCas9-NG：一種識別“NG”PAM序列的Cas9
2018年9月21日，Osamu Nureki團(tuán)隊(duì)通過合理的設(shè)計(jì)，開發(fā)了一種識別NG而不是NGG的SpCas9突變體（SpCas9-NG）。SpCas9-NG增加了靶向范圍，且具有與野生型SpCas9相似的特異性，還可以與其他編輯器（胞苷脫氨酶）一起使用。因此，SpCas9-NG有效地補(bǔ)充了CRISPR工具箱，將在從基礎(chǔ)研究到臨床治療等廣泛應(yīng)用中發(fā)揮重要的作用[11]。

4. ScCas9: 利用生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)的PAM僅含一個(gè)“G”的Cas9
2018年10月24日，來自美國麻省理工學(xué)院的研究人員構(gòu)建了一個(gè)自動化的生物信息學(xué)管道，通過目標(biāo)比對搜索PAMs ( SPAMALOT )，進(jìn)一步探索了被忽略的Cas9鏈球菌直形菌株的微生物PAM多樣性，發(fā)現(xiàn)了一種來自犬鏈球菌的Cas9（ScCas9），展示了其在細(xì)菌和人類細(xì)胞中的精確編輯能力。ScCas9的 PAM序列為5’-NNGTT-3’，且僅含一個(gè)堿基G，因此能靶向SpCas9不能的靶DNA序列且位點(diǎn)更多。ScCas9即可作為替代的基因組編輯工具，也可作為發(fā)現(xiàn)新的鏈球菌PAM特異性的功能平臺[12]。

三、CRISPR系統(tǒng)核酸酶作用機(jī)制研究取得階段性進(jìn)展
Cas蛋白是CRISPR/Cas系統(tǒng)中的一類核酸酶，目前已鑒定出至少45個(gè)Cas蛋白家族。研究人員已通過冷凍電鏡技術(shù)來解析其蛋白結(jié)構(gòu)以及作用機(jī)制，為認(rèn)識基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用以及改造CRISPR系統(tǒng)提供了基本的結(jié)構(gòu)和理論基礎(chǔ)[13]�，F(xiàn)在，各種新型Cas蛋白被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和解析，這將為開發(fā)新型CRISPR系統(tǒng)以及在將來高效地運(yùn)用于基因治療奠定基礎(chǔ)。

1. 兩篇研究揭示Cas4核酸酶對于CRIPSR免疫反應(yīng)的重要性
2018年3月27日的，Shiimori團(tuán)隊(duì)在Cell Reports期刊上發(fā)文，證明了Cas4核酸酶是間隔序列前體臨近基序( PAMs )靶向選擇所必須的，有助于Cas1和Cas2選擇新的CRISPR間隔物，并賦予天然宿主Synechocystis I- D CRISPR干擾能力[14]。同年，Shiimori團(tuán)隊(duì)于6月7日在Molecular Cell期刊上發(fā)表了工作，展示了Cas4在嗜熱古菌P. furiosus中通過DNA序列整合的方式進(jìn)行CRISPR-Cas免疫反應(yīng)，并確定了兩種Cas4（Cas4-1和Cas4-2 )在P. furiosus CRISPR間隔區(qū)DNA片段的獲取及在原間隔區(qū)加工中的關(guān)鍵作用。另一方面，Cas4確保CRISPR間隔區(qū)在一個(gè)特定的方向上整合，最終觸發(fā)CRISPR免疫反應(yīng)[15]。總而言之，這些發(fā)現(xiàn)為Cas4核酸酶在CRISPR陣列的關(guān)鍵作用，為原間隔區(qū)生成和功能間隔區(qū)整合提供了體內(nèi)依據(jù)。
2. 冷凍電鏡技術(shù)助力進(jìn)一步解析CRISPR/Cas系統(tǒng)工作機(jī)理
盡管CRISPR系統(tǒng)已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)到生物技術(shù)或合成生物學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域，但目前人們對其精細(xì)的工作機(jī)制仍然缺乏詳細(xì)了解。今年三篇突破性的研究通過低溫冷凍電鏡技術(shù)分別揭示了不同CRISPR系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)以及工作機(jī)制，為CRISPR/Cas系統(tǒng)的改進(jìn)及臨床治療提供了重要的理論基礎(chǔ)。

1) I型CRISPR/Cas系統(tǒng)分子作用機(jī)制闡釋：2018年7月6日，來自美國康奈爾大學(xué)和哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員在Science期刊上發(fā)文，研究利用單顆粒低溫電鏡技術(shù)（cryo-EM）解析TfuCascade/R-loop/Cas3三元復(fù)合物在R-loop切割前后的結(jié)構(gòu)，揭示了人們困惑的Cas3招募、DNA切割和降解機(jī)制。這些研究為理解I型CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子作用機(jī)制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[16]。
2) Cas13d功能結(jié)構(gòu)研究：2018年9月20日，美國Salk研究所的科學(xué)家們利用冷凍電鏡解析了Cas13d-sgRNA二元復(fù)合物和Cas13d-sgRN-靶點(diǎn)RNA三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及一系列動態(tài)過程，這使得我們更詳細(xì)地看到Cas13d-系統(tǒng)如何被引導(dǎo)到RNA并切割的過程。這為我們改進(jìn)CRISPR系統(tǒng)，使其更為有效地為RNA的疾病治療奠定基礎(chǔ)[17]。
3) Cas12d構(gòu)象循環(huán)解析：2018年12月13日，來自諾和諾德基金會中心的研究人員利用一種低溫電鏡技術(shù)，闡明了Cas12a靶向DNA切割和隨意降解ssDNA的工作機(jī)制，揭示了Cas12a切割其靶DNA，釋放非特異性切割活性，激活后降解ssDNA分子等工作機(jī)制。這使得我們可以通過調(diào)整CRISPR引擎來達(dá)到特定的預(yù)期效果[18]。

四、基于CRISPR系統(tǒng)的基因編輯研究取得突破性進(jìn)展
CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)在人類治療應(yīng)用方面具有巨大的潛能，充分了解體內(nèi)編輯系統(tǒng)的修復(fù)機(jī)制將有助于我們更加高效且準(zhǔn)確地進(jìn)行基因編輯，為安全有效的臨床應(yīng)用提供充足的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1. 范可尼貧血通路在CRISPR-Cas9編輯形成DSBs修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用
2018年8月，美國加州大學(xué)伯克利分校的研究人員在Nature Genetics期刊上發(fā)表的研究工作，顛覆了之前的“細(xì)胞在Cas9酶剪切DNA后修復(fù)基因”的假說，研究人員通過CRISPR干擾技術(shù)對2000多個(gè)基因進(jìn)行沉默，發(fā)現(xiàn)范可尼貧血通路（Fanconi anemia pathway）中的FANCD2蛋白會定位在Cas9誘導(dǎo)的DSBs上，表明它在調(diào)節(jié)基因組編輯中起著關(guān)鍵作用——調(diào)節(jié)FANCD2蛋白可以提高HDR頻率。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Fanconi貧血途徑同NHEJ無關(guān)，而是通過提高同源重組效率使得修復(fù)機(jī)制轉(zhuǎn)向單鏈模板修復(fù)機(jī)制，因而通過調(diào)控Fanconi貧血通路的活性可以提高HDR的編輯效率。這一發(fā)現(xiàn)將有助于提高在基因組中插入外源DNA的效率，并確保CRISPR編輯獲得預(yù)期的結(jié)果[19]。

2. 精準(zhǔn)且可預(yù)測的CRISPR染色體重排揭示Cas9介導(dǎo)的堿基插入規(guī)律
2018年7月19日，來自上海交通大學(xué)的吳強(qiáng)課題組在Molecular Cell期刊上發(fā)表了團(tuán)隊(duì)的最新研究成果，顛覆了現(xiàn)有的基因編輯理論。他們發(fā)現(xiàn)Cas9切割DNA產(chǎn)生的切口會產(chǎn)生突出末端，而不僅僅只有之前報(bào)道的平口末端的形式，同時(shí)利用高通量測序針對成對導(dǎo)向RNA編輯后DNA修復(fù)方式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)斷裂末端的修復(fù)方式是可預(yù)測的，呈現(xiàn)出非常有規(guī)律的形式。這一顛覆性的發(fā)現(xiàn)為優(yōu)化和改造基因編輯技術(shù)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[20]。
3. 無模板CRISPR/Cas9基因編輯的精準(zhǔn)性被揭示
長期以來，在沒有提供體模板的情況下，CRISPR切割后的修復(fù)通常被認(rèn)為是隨機(jī)且異質(zhì)的。2018年11月7日在Nature期刊上HMax W. Shen團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，通過CRISPR/Cas9靶向基因組的2000多個(gè)位點(diǎn)來檢測細(xì)胞是如何進(jìn)行修復(fù)的，結(jié)果顯示無模板的Cas9基因編輯是可預(yù)測的，經(jīng)編輯的基因并不包含大量的變異，而是一種單一的結(jié)果。同時(shí)他們通過導(dǎo)入這些大數(shù)據(jù)，建立了一種機(jī)器學(xué)習(xí)模型（indelphi），它可以高精度地預(yù)測五個(gè)人類和小鼠細(xì)胞系中基因編輯的修復(fù)結(jié)果，并且將這一預(yù)測用于測試人類疾病的修復(fù)效果。這種模型能將致病基因型精確修復(fù)到預(yù)測的基因型，從而能夠準(zhǔn)確地校正人類疾病相關(guān)的突變。這項(xiàng)研究為精確、無模板的基因組編輯建立了基礎(chǔ)[21]。
隨后，2018年11月27日Felicity Allen團(tuán)隊(duì)在Nature 也發(fā)文，他們合成構(gòu)建了超過4萬多對導(dǎo)向RNA和靶向DNA序列的編輯文庫系統(tǒng)探索CRISPR/Cas9的切割修復(fù)機(jī)制，明確了修復(fù)的結(jié)果是取決于靶向區(qū)域的DNA序列，大多數(shù)可再現(xiàn)的突變是單堿基插入、短的缺失或更長的微同源性介導(dǎo)的缺失的結(jié)果。同時(shí)也利用大數(shù)據(jù)開發(fā)了一種機(jī)器學(xué)習(xí)算法（FORECasT），能夠?qū)崿F(xiàn)僅使用靶位點(diǎn)DNA序列來預(yù)測糾正的結(jié)果[22]。這些機(jī)制的深入理解和新工具的開發(fā)將有助于人們更好地設(shè)計(jì)基因編輯實(shí)驗(yàn)。

綜上，為大家簡單介紹了2018年新型CRISPR系統(tǒng)的開發(fā)及機(jī)制研究方面的重要事件。目前CRISPR-Cas9已經(jīng)成為一種簡單、精確且快速的基因編輯技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及農(nóng)林牧等諸多生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，如醫(yī)學(xué)中常涉及眼疾、血液病以及其他遺傳病。同時(shí)我們也認(rèn)識到，這一技術(shù)依然存在許多問題以及諸多潛力有待繼續(xù)研究和拓展，我們相信在不久的將來CRISPR-Cas9將會在各個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)其不可估量的巨大價(jià)值。

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