菌種選育的步驟及需要注意的問題

菌種選育Loremreferentibus（英語：Strain selection 日語：ひずみの選択 法語：la sélection des souches 俄語：Штаммвыбор 德語：Stammselektion ）微生物菌種是決定發(fā)酵產(chǎn)品的工業(yè)價值以及發(fā)酵工程成敗的關(guān)鍵，只有具備良好的菌種基礎(chǔ)，才能通過改進(jìn)發(fā)酵工藝和設(shè)備以獲得理想的發(fā)酵產(chǎn)品。菌種用途廣泛涉及食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等諸多領(lǐng)域。
一、菌種選育的步驟
自然選育的步驟主要是：采樣，增長培養(yǎng)，培養(yǎng)分離和篩選等。
⒈采樣　篩選的菌種采集的對象以土壤為主，也可以是植物、腐敗物品和某些水域等。土壤是微生物的匯集地，從土壤中幾乎可以分離到任何所需的微生物，故土壤往往是首選的采集目標(biāo)。微生物的營養(yǎng)需求和代謝類型與生長環(huán)境有很大關(guān)系。
⒉富集培養(yǎng)　 由于采集樣品中各種微生物數(shù)量有很大差異，若估計到要分離的菌種數(shù)量不多時，就要人為增加分離的概率，增加該菌種的數(shù)量，稱為富集培養(yǎng)。
⒊純種培養(yǎng) 盡管通過增長培養(yǎng)的效果很好，但是得到的微生物還是處于混雜狀態(tài)，因為樣品中本身含有許多種類的微生物。所以，為了取得所需的微生物純種，增殖培養(yǎng)后必須進(jìn)行分離。
平板分離法由接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來。如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。
分離方法有三種：即劃線分離法、稀釋法和組織分離法。
稀釋分離法　在溶液中再加入溶劑使溶液的濃度變小。亦指加溶劑于溶液中以減小溶液濃度的過程。濃溶液的質(zhì)量×濃溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)=稀溶液的質(zhì)量×稀溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)生產(chǎn)能力考察　初篩一般通過平板稀釋法獲得單個菌落，然后對各個菌落進(jìn)行有關(guān)性狀的初步測定，從中選出具有優(yōu)良性狀的菌落。例如，對抗生素產(chǎn)生菌來說，選出抑菌圈大的菌落；對于蛋白酶產(chǎn)生菌來說，選出透明圈大的菌落。此法快速、簡便，結(jié)果直觀性強(qiáng)。缺點是培養(yǎng)皿的培養(yǎng)條件與三角瓶、發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件相差大，兩者結(jié)果常不一致。
二、菌種選育需要注意的問題
誘變育種應(yīng)注意的問題
（1）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株 出發(fā)菌株就是用于育種的原始菌株。出發(fā)菌株適合，育種工作效率就高。參考以下實際經(jīng)驗選用出發(fā)菌株：①以單倍體純種為出發(fā)菌株，可排除異核體和異質(zhì)體的影響；②采用具有優(yōu)良性狀的菌株，如生長速度快、營養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株；③選擇對誘變劑敏感的菌株。由于有些菌株在發(fā)生某一變異后，會提高對其它誘變因素的敏感性，故可考慮選擇已發(fā)生其他變異的菌株為出發(fā)菌株。④許多高產(chǎn)突變往往要經(jīng)過逐步累積的過程，才變得明顯，所以有必要多挑選一些已經(jīng)過誘變的菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行多步育種，確保高產(chǎn)菌株的獲得。
（2）菌懸液的制備 一般采用生理狀態(tài)一致（用選擇法或誘導(dǎo)法使微生物同步生長）的單細(xì)胞或孢子進(jìn)行誘變處理。所處理的細(xì)胞必須是均勻而分散的單細(xì)胞懸液。分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑，又可避免長出不純菌落。由于某些微生物細(xì)胞是多核的，即使處理其單細(xì)胞，也會出現(xiàn)不純的菌落。有時，雖然處理的是單核的細(xì)胞或孢子，但由于誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈，故某一突變無法反映在當(dāng)代的表型上，而是要經(jīng)過DNA的復(fù)制和細(xì)胞分裂后才表現(xiàn)出來，于是出現(xiàn)了不純菌落，這就叫表型延遲。上述兩類不純菌落的存在，也是誘變育種工作中初分離的菌株經(jīng)傳代后很快出現(xiàn)生產(chǎn)性狀“衰退”的主要原因。鑒于上述原因，因此用于誘變育種的細(xì)胞應(yīng)盡量選用單核細(xì)胞，如霉菌或放線菌的孢子或細(xì)菌的芽孢。
細(xì)胞的生理狀態(tài)對誘變處理也會產(chǎn)生很大的影響。細(xì)菌在對數(shù)期誘變處理效果較好；霉菌或放線菌的分生孢子一般都處于休眠狀態(tài)，所以培養(yǎng)時間的長短對孢子影響不大，但稍加萌發(fā)后的孢子則可提高誘變效率。
（3）選擇簡便有效、最適劑量的誘變劑 誘變劑主要有兩大類，即物理誘變劑和化學(xué)誘變劑。物理誘變劑如紫外線、X射線、γ射線和快中子等；化學(xué)誘變劑種類極多，主要有烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物。最常用的烷化劑有N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 、甲基亞硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)和環(huán)氧乙烷等。目前常用的誘變劑主要有紫外線(UV)、硫酸二乙酯、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝基甲基脲(NMU)等。后兩種因有突出的誘變效果，所以被譽(yù)為“超誘變劑”。劑量的選擇受處理條件、菌種情況、誘變劑的種類等多種因素的影響。劑量一般指強(qiáng)度與作用時間的乘積。在育種實踐中，常采用殺菌率來作各種誘變劑的相對劑量。要確定一個合適的劑量，通常要進(jìn)行多次試驗。在實際工作中，突變率往往隨劑量的增高而提高，但達(dá)到一定程度后，再提高劑量反而會使突變率下降。根據(jù)對紫外線、X射線和乙烯亞胺等誘變效應(yīng)的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)正變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變則較多地出現(xiàn)于偏高的劑量中，還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，更容易出現(xiàn)負(fù)變。因此，在誘變育種工作中，目前比較傾向于采用較低的劑量。例如，過去在用紫外線作誘變劑時，常采用殺菌率為99%的劑量，而近年來則傾向于采用殺菌率為30%～75%的劑量。
（4）突變體的篩選 誘變處理使微生物群體中出現(xiàn)各種突變型，其中絕大多數(shù)是負(fù)變株。要獲得預(yù)定的效應(yīng)表型主要靠科學(xué)的篩選方案和篩選方法，一般要經(jīng)過初篩和復(fù)篩兩個階段的篩選。