基因人源化動物模型應(yīng)用與構(gòu)建

古代祖先神農(nóng)嘗百草為治病救人，根本原因在于缺乏人類試藥的替身，只能以身試法。上一期我們介紹了一種“目前最接近人類臨床實(shí)際情況的腫瘤模型”——“PDX”人源化動物模型，今天我們繼續(xù)為大家介紹另一種十分重要的人源化動物模型——基因人源化模型。

人源化動物模型（Humanized Animal Model ）

指攜帶有人源的功能性基因、細(xì)胞、組織或者器官的動物模型，是目前常用的最接近人類的疾病研究動物模型。前幾期我們已經(jīng)介紹了人源細(xì)胞及組織的移植模型，本期著重介紹基因人源化的動物模型。

基因人源化動物模型   利用轉(zhuǎn)基因或同源重組的方法，將人源基因放在動物基因組內(nèi)，在動物體內(nèi)表達(dá)人源的基因，動物自身基因不再表達(dá)。

為什么進(jìn)行基因人源化呢？

小鼠與人類基因組雖具有高度同源性，但是很少有功能性基因在人鼠上具有100%的保守性，這種差異很可能會導(dǎo)致動物和人體結(jié)果的出入。如以下例子可以說明：

舉例1：如在藥物代謝中，利福平不能誘導(dǎo)小鼠肝臟中的CYP3A的表達(dá)，而將小鼠的PXR基因人源化之后，利福平表現(xiàn)出對小鼠肝臟CYP3A的強(qiáng)誘導(dǎo)作用�？梢娔Ｐ蛣游锏娜嗽椿�能在一定程度上，克服基因差異造成的種屬差異（下圖）[1]。

PXR的人源化能顯著增強(qiáng)利福平（RIF）對小鼠肝臟CYP3A的誘導(dǎo)作用

舉例2：又如在腫瘤免疫治療中，小鼠的免疫檢查點(diǎn)基因與人類對比，在蛋白氨基酸序列上相似性僅約60%。因此若選擇小鼠來檢測抗人蛋白抗體的藥效，抗體很可能不識別小鼠相應(yīng)蛋白。這就需要將小鼠的免疫檢查點(diǎn)基因進(jìn)行人源化改造，因此hPD-1小鼠應(yīng)運(yùn)而生。

舉例3：如在病毒感染中，表達(dá)野生型CD81和OCLN（occludin）的小鼠對HCV（HepatitisC Virus）不敏感，而在小鼠體內(nèi)表達(dá)這兩個基因的人源同源基因之后，小鼠便會受到HCV的感染[2]。

人源化動物模型應(yīng)用

基因人源化動物模型大大提高了模擬人類某些疾病的有效性，目前應(yīng)用很廣泛，如下：

①人類基因的功能研究，解碼人類疾病奧秘；

②腫瘤免疫治療研究，如h-PD-1小鼠；

③臨床前藥物評價：藥效，藥物代謝研究等；

④ 疾病研究：癌癥、傳染病、血液病研究等；

⑤組織或者器官供體動物的制備等。

下面看看，基因人源化模型是如何構(gòu)建的呢？

基本原理：運(yùn)用DNA定點(diǎn)同源重組的原理，將人源的基因的部分片段（如重要結(jié)構(gòu)域、編碼區(qū)等）或者基因全長（如所有外顯子和內(nèi)含子、啟動子區(qū)域、3’和5’-UTR等）定點(diǎn)整合到實(shí)驗(yàn)動物特定的基因位點(diǎn)，進(jìn)而達(dá)到替換掉實(shí)驗(yàn)動物的該基因的目的。如下圖所示：

人源化動物模型構(gòu)建示意圖

目前應(yīng)用較多的是利用ES細(xì)胞同源重組技術(shù)和CRISPR/Cas9顯微共注射技術(shù)構(gòu)建基因人源化動物模型。但由于ES細(xì)胞培養(yǎng)和操作的物種限制和得到純合人源化動物的周期也相對較長，因此該方法具有一定局限性。

CRISPR/Cas9是利用顯微共注射直接將CRISPR/Cas9系統(tǒng)和同源重組質(zhì)粒注射進(jìn)動物的受精卵，不需要培養(yǎng)和操作ES細(xì)胞，得到純合人源化動物的周期也相對較短，但缺少了體外篩選的過程，獲得陽性子代的概率就相對較小。

構(gòu)建注意事項(xiàng)

基因人源化的本質(zhì)即基因大片段敲入，構(gòu)建過程在之前的KI文章描述過，不再贅述。需要注意的是：構(gòu)建基因人源化動物模型的關(guān)鍵在于提高人源基因同源重組效率，目前有以下幾個方向：

①優(yōu)化同源重組載體同源臂的長度；

②在Cas9上融合表達(dá)能提高同源重組的蛋白；

③抑制非同源重組末端連接的發(fā)生；

④ES細(xì)胞的體外篩選，可以提高陽性子代的獲得率，所以開發(fā)更多物種的ES細(xì)胞的培養(yǎng)和操作方法也能間接提高同源重組的成功率。

下面以2個較常用的模型為例，為大家詳細(xì)講解：

一、人源化藥物代謝動物模型

藥物的吸收、分布、代謝以及消除（ADME）影響著藥物在人體內(nèi)的有效性和安全性，其中人體的幾類蛋白扮演著重要角色，然而它們卻在人鼠之間卻存在很大差異。

①如幾個主要參與藥物代謝的CYP450酶，其人鼠之間基因序列的相似性大都75%左右，其中最重要CYP3A，人鼠間序列的相似性不足70%[3]；

②且人鼠間CYP450酶的亞型分布也有較大差異；人CYP2C的亞型僅有CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19四個亞型，但大鼠和小鼠中分別有七個和九個CYP2C亞型[3]；

③對于異型生物質(zhì)受體，不同物種間的同源受體可能對同一物質(zhì)具有不同的敏感性。如上文提到的人源的PXR對RIF敏感，而鼠源的PXR對PCN敏感[1]。

因此，普通小鼠上進(jìn)行的藥物評價是僅僅不夠的，將這些關(guān)鍵基因在動物上進(jìn)行人源化，建立基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)譜和調(diào)節(jié)方式與人類相似的模型，才是解決種屬差異的有效途徑之一。

目前國際上已有一些人類藥物相關(guān)基因人源化小鼠，比如CYP3A4人源化小鼠，PXR-CAR雙基因人源化小鼠，AHR人源化小鼠等。近幾年來，由于CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的成熟，使大鼠的人源化成為可能。

我國已經(jīng)建立了一些藥物代謝基因的大鼠模型，如Abcb1、AHR人源化大鼠模型。

下面以Cyp3a4/Cyp3a7/PXR/CAR多基因人源化小鼠模型構(gòu)建為例：

CYP3A4（Cytochrome P450 3A4）是人肝腸中主要表達(dá)的一個Ⅰ相藥物代謝酶，參與了約50%的臨床藥物的代謝。但人和小鼠之間的Cyp3a基因具有較大種屬差異，使得候選化合物在小鼠的代謝情況與人的代謝情況存在一定差異。

另外，PXR（Pregnane X Receptor）和CAR（Constitutive Androstane Receptor）是Cyp450上游的調(diào)節(jié)基因，能參與到Cyp3a4等亞型的誘導(dǎo)表達(dá)。PXR、CAR具有的人鼠差異也會影響小鼠模型對化合物的代謝研究結(jié)果在人上的可適用性。

如下圖為：Cyp3a4/Cyp3a7/PXR/CAR多基因人源化模型的構(gòu)建過程

Cyp3a4/Cyp3a7/PXR/CAR人源化小鼠模型構(gòu)建 [4]

具體可簡述為如下步驟 [4]：

1、為敲除小鼠Cyp3a57-Cyp3a25基因簇，分別構(gòu)建包含篩選標(biāo)記和loxP等位點(diǎn)的靶向小鼠Cyp3a57和Cyp3a59的打靶載體（如上圖A-C所示）；

2、將1中打靶載體轉(zhuǎn)入小鼠ES細(xì)胞，針對Cyp3a57-Cyp3a25基因簇的5’和3’端，通過同源重組引入兩個同向loxP位點(diǎn)（如上圖D所示）；

3、通過在小鼠ES細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Cre質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)由Cre-loxP介導(dǎo)的Cyp3a57-Cyp3a25基因簇的缺失（如上圖E所示）；

4、構(gòu)建含loxP位點(diǎn)和人源Cyp3a4/Cyp3a7基因片段的打靶載體（如上圖F所示）；

5、將4中打靶載體轉(zhuǎn)入3中ES細(xì)胞，通過Cre-loxP介導(dǎo)的不同DNA鏈間的染色體易位實(shí)現(xiàn)人源Cyp3a4/Cyp3a7基因的定點(diǎn)整合（如上圖G、H所示）；

6、體外編輯好的ES細(xì)胞經(jīng)囊胚注射、嵌合鼠繁殖，背景純化，最終獲得純合子Cyp3a4/Cyp3a7人源化小鼠;

7、將Cyp3a4/Cyp3a7人源化小鼠和PXR、CAR人源化小鼠進(jìn)行雜交，即可獲得Cyp3a4/Cyp3a7/PXR/CAR人源化小鼠。

構(gòu)建時需要注意的事項(xiàng)

對于多基因人源化，若兩個基因不在同一條染色體上，一般先分別進(jìn)行打靶，然后再將單個基因人源化小鼠進(jìn)行交配，得到多基因人源化小鼠。在這個過程中，一定要驗(yàn)證每一個單基因人源化小鼠是正確而有功能的。由于Cyp450基因亞型眾多，這給Cyp450全基因敲除和人源化帶來了一定難度。

數(shù)據(jù)分析：如下圖所示，研究人員通過構(gòu)建Cyp3a4/Cyp3a7/PXR/CAR多基因人源化小鼠模型，觀察到了RIF，磺吡酮（SUL）以及吡格列酮（PIO）成功通過人源PXR誘導(dǎo)人源CYP3A4的表達(dá)，在一定程度上克服了種屬差異[4]。

Cyp3a4/ Cyp3a7/PXR/CAR人源化小鼠對藥物具有和人相似的敏感性[4]

二、 PD-1人源化小鼠

腫瘤免疫療法是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域中最具前景的研究方向之一，特別是T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)抗體成為了腫瘤治療的有力主角，包括PD-1、PD-L1和CTLA4等。

PD-1，即程序性死亡受體1，是一種重要的免疫抑制分子，PD-1抑制劑是目前非�；钴S的一個腫瘤免疫治療藥物。如下為PD-1抑制劑作用原理：

PD-1抑制劑作用原理圖（圖片來自網(wǎng)絡(luò)）

但是，該療法要求實(shí)驗(yàn)動物須具備正常的免疫系統(tǒng)，同時，表達(dá)人類免疫檢查點(diǎn)分子。因此需要對動物的PD-1進(jìn)行人源化，即將小鼠的PD-1基因換成人的對應(yīng)部分，才可更為精準(zhǔn)地評價PD-1抗體藥物在人體內(nèi)的作用。

PD-1人源化小鼠的構(gòu)建過程可簡述為如下步驟 [5]：

1、構(gòu)建包含人源PD-1基因胞外蛋白對應(yīng)序列（包括第二個外顯子的全部序列和第三個外顯子的部分序列）的打靶載體；

2、將打靶載體轉(zhuǎn)入小鼠ES細(xì)胞，經(jīng)篩選標(biāo)記篩選出正確整合的ES細(xì)胞；

3、將整合正確的ES細(xì)胞注射進(jìn)八細(xì)胞期小鼠胚胎，得到嵌合體子代；

4、嵌合體子代與C57BL/6N進(jìn)行雜交，經(jīng)背景純化最終得到純合的PD-1人源化小鼠模型。

如下圖所示：人源化PD-1小鼠可用于PD1抑制劑的評價：

PD-1抗體REGN2810能顯著性增加人源化小鼠的生存率[5]

生命醫(yī)學(xué)的研究離不開動物實(shí)驗(yàn)，然而實(shí)驗(yàn)動物和人之間的種屬差異是客觀存在的。因此，人源化動物的研究必定是生命醫(yī)學(xué)研究中十分重要的一環(huán)。

目前，在這個領(lǐng)域還存在許多需要攻克的困難和需要思考的問題，比如人源化動物模型構(gòu)建技術(shù)的改良及新技術(shù)的發(fā)明，模型構(gòu)建成本的控制，以及隨著人源化動物越來越“像人”所帶來的一系列倫理問題等。

當(dāng)然，動物實(shí)驗(yàn)中最基本的一個倫理問題就是動物福利，實(shí)驗(yàn)動物是人類的受難者，是人類實(shí)驗(yàn)的替代品，在進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)時請務(wù)必善待你的實(shí)驗(yàn)動物。

致謝：感謝陳曦同學(xué)在基因編輯技術(shù)理論方面提供的幫助！

參考資料：

[1] Ma, X. et al. The PREgnane X receptor gene-humanized mouse: a model for investigating drug-drug interactions mediated by cytochromes P450 3A. Drug Metab. Dispos. 35, 194-200, doi:10.1124/dmd.106.012831 (2007).

[2] Ding, Q. et al. Mice Expressing Minimally Humanized CD81 and Occludin Genes Support Hepatitis C Virus Uptake In Vivo. J. Virol. 91, doi:10.1128/JVI.01799-16 (2017).

[3] Martignoni, M., Groothuis, G. M. & de Kanter, R. Species differences between mouse, rat, dog, monkey and human CYP-mediated drug metabolism, inhibition and induction. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 2, 875-894, doi:10.1517/17425255.2.6.875 (2006).

[4] Hasegawa, M. et al. Quantitative prediction of human pregnane X receptor and cytochrome P450 3A4 mediated drug-drug interaction in a novel multiple humanized mouse line. Mol. Pharmacol. 80, 518-528, doi:10.1124/mol.111.071845 (2011).

[5] Burova, E. et al. Characterization of the Anti-PD-1 Antibody REGN2810 and Its Antitumor Activity in Human PD-1 Knock-In Mice. Mol. Cancer Ther. 16, 861-870, doi:10.1158/1535-7163.MCT-16-0665 (2017).