腫瘤動(dòng)物模型的構(gòu)建——結(jié)直腸癌篇

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)屬于世界上第三大最常見的惡性腫瘤。近年來，隨著生活水平的提高，國內(nèi)外結(jié)直腸癌的發(fā)病率保持著穩(wěn)定增長的態(tài)勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。因此，建立合適、可靠的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型，對(duì)于其病程機(jī)理研究和臨床藥物治療都具有重大意義。

首先，讓我們了解一下結(jié)直腸癌發(fā)展過程

結(jié)直腸癌隨著疾病的發(fā)展，其遺傳學(xué)的改變主要包括基因組的不穩(wěn)定性、癌基因的突變擴(kuò)增和抑癌基因的突變失活。如下圖所示，主要包括APC、KRAS、SMAD2/4、TP53等基因的突變導(dǎo)致正常結(jié)腸組織逐漸轉(zhuǎn)化為結(jié)直腸癌腫瘤組織并發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[1]。

根據(jù)結(jié)直腸癌突變類型，進(jìn)一步又分為多種細(xì)胞系

選擇合適的腫瘤細(xì)胞系是我們成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃捅ＷC研究數(shù)據(jù)準(zhǔn)確的關(guān)鍵。

那么常見的結(jié)直腸癌模型有哪些呢？

結(jié)直腸癌研究中動(dòng)物模型主要分為3種類型

一、誘導(dǎo)結(jié)直腸癌模型（化學(xué)物質(zhì)、物理、生物等因素誘導(dǎo)）

評(píng)價(jià)：制作方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性較好，廣泛應(yīng)用于腸炎相關(guān)性癌癥發(fā)生和發(fā)展的研究。

以應(yīng)用比較廣泛的AOM/DSS誘導(dǎo)結(jié)直腸癌模型為例：

二、移植結(jié)直腸癌模型（CDTX和PDTX）

評(píng)價(jià)：成瘤率高、實(shí)驗(yàn)周期短，常用于藥物研發(fā)，是研究中最常用的結(jié)直腸癌模型。

再具體了解一下結(jié)直腸癌根據(jù)移植部位的分類：

1. 皮下荷瘤：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長情況和評(píng)估治療效果，但不易發(fā)生轉(zhuǎn)移。步驟往期已有描述；

2. 尾靜脈注射（肺轉(zhuǎn)移）：肺部是結(jié)直腸癌常轉(zhuǎn)移器官[2]，主要用于抑制腫瘤肺轉(zhuǎn)移的藥物篩選與檢測(cè)。步驟和數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)分析，往期已有描述，不再贅述；

3. 脾臟注射（肝轉(zhuǎn)移）：肝臟是結(jié)直腸癌最常轉(zhuǎn)移的器官[2]，主要用于抑制腫瘤肝轉(zhuǎn)移的藥物篩選與檢測(cè)。脾臟注射模型具有造模方法簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)移率高的優(yōu)點(diǎn)，能較好地模擬結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的臨床特征[3]；

下圖所示為脾臟注射大概步驟和視頻分析，具體實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)節(jié)請(qǐng)參照前文：腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的構(gòu)建（下）。

脾臟注射詳細(xì)步驟請(qǐng)參考視頻：
https://v.qq.com/x/page/y05165f1l2r.html
溫馨提示：請(qǐng)?jiān)赪i-Fi下觀看，土豪隨意

4. 原位移植：既可用于抑制腫瘤生長又可用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物的篩選與檢測(cè)，彌補(bǔ)了皮下移植和脾臟注射的不足，更能表達(dá)臨床結(jié)直腸癌的生物學(xué)特性，是一種更接近人體腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的模型。

原位移植模型實(shí)驗(yàn)步驟：

注意事項(xiàng)：

1. 注意無菌操作；所需的器械和操作臺(tái)均需滅菌。取腫瘤標(biāo)本前用酒精棉球?qū)﹂L瘤部位進(jìn)行擦拭，切取腫瘤標(biāo)本后，應(yīng)放在加有抗生素的無血清培養(yǎng)基中，進(jìn)行無菌操作，操作盡量快速，以提高成瘤率；

2. 對(duì)裸鼠進(jìn)行腫瘤組織移植時(shí)，注意不要損壞腸組織的完整，防止瘤塊漏出來；

3. 可增加10%的Matrigel增加瘤塊的粘附、幫助生長和快速適應(yīng)腸組織微環(huán)境；

4. 在CDTX模型中，根據(jù)研究的結(jié)直腸癌類型以及基因型選取相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞系（參考上表），不同腫瘤細(xì)胞系的成瘤率不同，結(jié)合自身選取成瘤率高的細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

數(shù)據(jù)分析：

如下圖：BALB/c裸鼠原位注射腺癌細(xì)胞HCT116-GFP后，結(jié)直腸癌細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移到肝臟[4]。

三、基因修飾的結(jié)直腸癌模型

評(píng)價(jià)：腫瘤的發(fā)生發(fā)展在理論上與原發(fā)腫瘤基本一致，主要用于其發(fā)病原因、機(jī)制等研究，也可用于靶點(diǎn)藥物療效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究深入及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的普及，本法將漸趨成熟。

主要分類：

1. 遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）：HNPCC是APC基因失活致雜化性缺失，錯(cuò)配基因(MLH-l、MLH-2、MLH-6、PMS-1、PMS-2)突變所致�；�因敲除MLH-l或MLH-2基因的純合子小鼠，淋巴細(xì)胞會(huì)發(fā)生瘤變，同時(shí)也易患胃腸道的腫瘤，可以作為研究HNPCC很好的模型。

2. 家族性腺瘤性息肉�。‵AP）：APC-β-catenin-TCF 主導(dǎo)的Wnt通路失調(diào)是FAP 發(fā)生的主要途徑。APC基因其中一條鏈的第850號(hào)密碼子等位突變引起腸道多發(fā)性腺瘤，因而被稱之為Min(multiple intestinal neoplasia)小鼠，被認(rèn)為是當(dāng)前較為理想的家族性腺瘤性息肉病(FAP)的研究模型。

3. 目前也有其他許多靶向敲除的小鼠如Msh2 敲除小鼠、k-ras 敲除小鼠、p53 敲除小鼠等。

數(shù)據(jù)分析：

以Apc(Min/+)突變小鼠為例，正常C57BL/J6小鼠幾乎沒有生成結(jié)直腸癌腫瘤，而Apc(Min/+)突變小鼠在腫瘤大小和數(shù)量上都有顯著增加：

根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮侠淼剡x擇結(jié)直腸癌動(dòng)物模型，是發(fā)表優(yōu)秀文章不可缺少的實(shí)驗(yàn)，本期我們繼續(xù)不遺余力的為大家綜述了多種常用的結(jié)直腸癌模型，希望對(duì)大家有所幫助。

參考文獻(xiàn)：

[1] Davies R J, Miller R, Coleman N, et al. Colorectal cancer screening: prospects for molecular stool analysis[J]. Nature Reviews Cancer, 2005, 5(3): 199-209.

[2] Nguyen D X, Bos P D, Massague J, et al. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization[J]. Nature Reviews Cancer, 2009, 9(4): 274-284.

[3] Okamoto K, Ishiguro T, Midorikawa Y, et al. miR‐493 induction during carcinogenesis blocks metastatic settlement of colon cancer cells in liver[J]. The EMBO Journal, 2012, 31(7): 1752-1763. 

[4] Rajput A, Martin I D, Rose R, et al. Characterization of HCT116 Human Colon Cancer Cells in an Orthotopic Model[J]. Journal of Surgical Research, 2008, 147(2): 276-281. 

[5] Inna Naumov · Alona Zilberberg · Shiran Shapira , et al. CD24 knockout prevents colorectal cancer in chemically induced colon carcinogenesis and in APCMin/CD24 double knockout transgenic mice[J].  International Journal of Cancer . 2014.