如何實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤

上一期我們?cè)敿?xì)介紹了皮下荷瘤的測(cè)量和計(jì)算方法，但是卡尺測(cè)量存在很大局限性，如對(duì)于原位或者轉(zhuǎn)移腫瘤模型，是無(wú)法適用的。由此，一種名為IVIS的高效檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，可以實(shí)時(shí)追蹤小鼠體內(nèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本期我們就為大家介紹一下：基于Luciferase 的IVIS生物發(fā)光成像系統(tǒng)在腫瘤檢測(cè)中的應(yīng)用及操作手法。

什么是（IVIS, in vivo Imaging system）

IVIS即小動(dòng)物活體成像體統(tǒng)，通過(guò)一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器，主要基于生物發(fā)光（Luc等標(biāo)記）或熒光（GFP等標(biāo)記）原理直接監(jiān)控活體動(dòng)物體內(nèi)組織、細(xì)胞或分子等行為。

如下圖：左：IVIS Lumina III 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，包括一個(gè)高度靈敏的CCD相機(jī)及成像暗箱和成像軟件，右：對(duì)應(yīng)荷瘤小鼠放置暗箱后的原理圖。

IVIS Lumina III成像系統(tǒng)（來(lái)自PerkinElmer）   Luc-細(xì)胞的活體成像模式圖[1]

IVIS主要包括生物發(fā)光或熒光原理，在腫瘤研究中基于生物發(fā)光的熒光素酶(Luciferase, Luc)基因標(biāo)記細(xì)胞，更為常用。

為什么腫瘤研究主要用Luc標(biāo)記的生物發(fā)光呢？

主要在于生物發(fā)光可獲得更加真實(shí)可靠的數(shù)據(jù)。熒光信號(hào)雖遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。從目前發(fā)表的高水平文章來(lái)看，大部分還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來(lái)研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像。下面我們就具體介紹。

基于生物發(fā)光的IVIS監(jiān)測(cè)腫瘤的優(yōu)勢(shì)

1. 能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

我們知道卡尺測(cè)量只限于皮下腫瘤，無(wú)法監(jiān)測(cè)體內(nèi)原位或轉(zhuǎn)移腫瘤。最傳統(tǒng)的方法即一次性獲得很多荷瘤小鼠，每一階段處死一批，取出小鼠體內(nèi)腫瘤獲得統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。這明顯是很愚笨低效的辦法。而IVIS可以長(zhǎng)時(shí)間并階段性地、無(wú)創(chuàng)傷地定量檢測(cè)小鼠原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。

如下圖：熒光標(biāo)記的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB231-luc，注射到小鼠第四對(duì)乳房墊，構(gòu)建乳腺癌原位模型。利用IVIS可以每隔幾天對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)。

MDA-MB231-luc在裸鼠體內(nèi)成像圖[2]

2. IVIS相比皮下測(cè)量，更加靈敏

如卡尺測(cè)量是當(dāng)腫瘤組織長(zhǎng)到綠豆大小才開(kāi)始統(tǒng)計(jì)，對(duì)于之前這段時(shí)間，我們的信息是空白的，如細(xì)胞是否生長(zhǎng)或者壞死；又如，當(dāng)腫瘤組織長(zhǎng)到一定階段，盡管體積未變化，但是腫瘤細(xì)胞已出現(xiàn)了壞死[3]。

如下圖：輝瑞上市的抗癌藥物Sutent，卡尺測(cè)量發(fā)現(xiàn)藥物處理組的PC-3M-Luc 皮下腫瘤體積仍在緩慢生長(zhǎng)，但I(xiàn)VIS卻發(fā)現(xiàn)，藥物組光學(xué)信號(hào)顯著降低，即表明細(xì)胞已經(jīng)死亡。IVIS結(jié)果，使得輝瑞順利通過(guò)FDA認(rèn)證[4]。

輝瑞上市藥物Sutent的臨床前結(jié)果[4]

綜上所述，IVIS因可獲取更加準(zhǔn)確直觀的結(jié)果，且操作簡(jiǎn)單快捷，盡管才發(fā)展幾年，但已廣泛用于抗腫瘤藥物研發(fā)及腫瘤機(jī)理研究。下面就一起來(lái)學(xué)習(xí)一下IVIS系統(tǒng)的操作。

如何用IVIS進(jìn)行腫瘤監(jiān)測(cè)

小動(dòng)物活體成像，基本原理是利用軟件及成像系統(tǒng)，將Luc標(biāo)記的細(xì)胞在小鼠體內(nèi)荷瘤，當(dāng)給小鼠注射底物熒光素(luciferin)時(shí)，熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，氧化過(guò)程中會(huì)發(fā)出生物熒光，幾分鐘內(nèi)就可獲得統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

基本步驟如下圖：

Luc標(biāo)記的IVIS操作步驟

注意事項(xiàng)：

• 穩(wěn)轉(zhuǎn)Luc細(xì)胞株必須在體外檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)后，才可以用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；

• 底物濃度一般為150mg/kg; 如一只8周雄性裸鼠約20g，那么一只小鼠需要3mg底物；一般用無(wú)菌PBS溶解。

• 雖然IVIS上帶有氣麻機(jī)，但是一般還是先將小鼠氣麻好，再放置于機(jī)器；

• 在使用軟件時(shí)，成像前需要設(shè)置軟件的多個(gè)參數(shù)，如小鼠成像時(shí)間（3-5min）、熒光最大值及最小值、溫度及建立不同組的文件夾等。

• 因?yàn)槌上竦男∈髨D片后續(xù)可能要用于文章發(fā)表等，所以一定要擺放整齊。

詳細(xì)操作步驟可以參考JOVE的視頻地址：https://www.jove.com/video/1210/

常見(jiàn)問(wèn)題解答

1. 一般細(xì)胞注射多久，可以上機(jī)成像？

一般在注射細(xì)胞30分鐘后利用IVIS監(jiān)測(cè)細(xì)胞位置及數(shù)量，并且馬上進(jìn)行分組。

2. 剛注射的Luc細(xì)胞，IVIS上看不到發(fā)光圖片，有哪些原因？

考慮Luc細(xì)胞本身問(wèn)題；機(jī)器參數(shù)設(shè)置是否有問(wèn)題，如我們可以在軟件上設(shè)置熒光最大值和最小值的范圍，若最小值較大，會(huì)造成看不到發(fā)光圖片。

3. 注射的Luc細(xì)胞，多久之內(nèi)可以觀察成像？

熒光素脂溶性非常好, 很容易透過(guò)血腦屏障。一般腹腔注射10min后，即可麻醉后上機(jī)；一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30-45min，所以操作盡快完成。

數(shù)據(jù)分析及應(yīng)用

1. 抗腫瘤藥物研發(fā)

如上圖中輝瑞上市的抗癌藥物Sutent，通過(guò)IVIS可以直接快速地測(cè)量腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，從而實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估藥物的效果。

2. 也可以用于癌癥分子機(jī)理的研究

將癌癥相關(guān)的目的基因和熒光素酶標(biāo)記，整合一起構(gòu)建共表達(dá)載體，通過(guò)發(fā)光信號(hào)，反應(yīng)基因表達(dá)情況，進(jìn)而推測(cè)基因與腫瘤發(fā)展的關(guān)系。

如下圖：研究者將一個(gè)熒光素酶基因質(zhì)粒與帶有致癌基因ras、四環(huán)素反式激活因子tTA (tet-off)及四環(huán)素依賴(lài)性p53 shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染成肝細(xì)胞后，接種于小鼠肝臟。結(jié)果顯示，當(dāng)p53的表達(dá)被shRNA抑制時(shí)，生物發(fā)光觀測(cè)到的腫瘤信號(hào)逐漸增強(qiáng)；當(dāng)用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)后，信號(hào)減弱，進(jìn)而說(shuō)明p53的表達(dá)能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)[5]。

IVIS觀測(cè)p53基因表達(dá)下降或上升對(duì)于肝癌發(fā)生的作用 [5]

IVIS由于能夠?qū)崟r(shí)追蹤腫瘤在體內(nèi)的位置及生長(zhǎng)情況，并且快捷地提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，已應(yīng)用于腫瘤研究多個(gè)領(lǐng)域。所以這是一項(xiàng)非常重要的監(jiān)測(cè)手段。希望看了我們的文章，能給你帶來(lái)幫助。有任何問(wèn)題，歡迎留言討論！

參考文獻(xiàn)

[1] https://www.jove.com/video/1210/

[2] Zhang T, Chen Y, Li J, et al. Antitumor action of a novel histone deacetylase inhibitor, YF479, in breast cancer.[J]. Neoplasia, 2014, 16(8): 665-677.

[3] Lim, E., Modi, K.D., Kim, J. In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum. J. Vis. Exp. (26), e1210, doi:10.3791/1210 (2009).

[4] Mendel DB, Laird AD, Xin X, et al. In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors: determination of a pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship. Clin Cancer Res. January 2003;9(1):327-337.

[5] Xue W, Zender L, Miething C, et al. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas[J]. Nature, 2007, 445(7128): 656-660.