Circulation│c-kit 細(xì)胞對(duì)成體心肌細(xì)胞貢獻(xiàn)的再評(píng)價(jià)

7月8日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Circulation在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所周斌研究組與中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聶宇課題組的最新科研成果“Reassessment of c-Kit⁺ Cells for Cardiomyocyte Contribution in Adult Heart”。

該研究利用雙同源重組系統(tǒng)(Cre-loxP和Dre-rox)構(gòu)建了兩個(gè)可以有效標(biāo)記Kit⁺細(xì)胞且不影響內(nèi)源Kit基因表達(dá)的小鼠模型，并利用這些模型對(duì)Kit⁺的心臟干細(xì)胞(CSCs)是否參與成體心肌細(xì)胞的生成進(jìn)行了探討。

研究結(jié)果顯示，無(wú)論心臟處于穩(wěn)態(tài)或損傷狀態(tài)下，都不會(huì)參與新生的心肌細(xì)胞的生成。 

南模生物為該研究構(gòu)建了Kit-2A-Cre、Kit-IRES-Cre和Tnnt2-DreER這三個(gè)小鼠模型。

限于之前的小鼠模型無(wú)法有效追蹤C(jī)SCs的命運(yùn)，Kit⁺ CSCs是否具有肌源潛能一直存在爭(zhēng)議[1-3]。

去年發(fā)表在Nature上的一篇文章對(duì)已有的Kit-Cre模型進(jìn)行了總結(jié)，并概括了現(xiàn)有模型的兩大缺陷：1)構(gòu)建時(shí)同源重組酶Cre取代了內(nèi)源Kit基因的表達(dá)，從而引發(fā)單倍體不足(haploinsufficiency)，即單個(gè)Kit等位基因不足以維持其正常功能；2)無(wú)法標(biāo)記Kit表達(dá)量低的細(xì)胞。

為了解決Kit⁺ CSCs是否具有肌源潛能這一問(wèn)題，本研究另辟蹊徑，構(gòu)建了2個(gè)全新的Kit-Cre工具鼠品系(Fig.1)。為了避免對(duì)c-Kit基因產(chǎn)生影響，研究人員選擇將Cre插入到Kit的最后一個(gè)外顯子后，并通過(guò)2A或者IRES元件分隔，從而實(shí)現(xiàn)與內(nèi)源Kit共同表達(dá)的目的。

Fig.1 Schematic figure showing knock-in strategies for Kit-2A-Cre or Kit-IRES-Crealleles by homologous recombination.

Kit^{2A-Cre/2A-Cre} 和 Kit^{IRES-Cre/IRES-Cre}純合子小鼠可以正常存活至成年，檢測(cè)野生型、純合子、雜合子小鼠在大小、體重以及心臟大小、體重占比、功能等生理指標(biāo)均沒(méi)有差別，并且Kit在純合小鼠中表達(dá)完整(Fig.2)。

Fig.2 Immunostaining for c-Kit on heart sections show its expression in tissues ofall groups (12–16W).

為了確定同時(shí)標(biāo)記Kit⁺細(xì)胞和心肌細(xì)胞，研究人員首先選擇用心肌細(xì)胞特異表達(dá)的Tnnt2基因標(biāo)來(lái)記心肌細(xì)胞，為此構(gòu)建了Tnnt2–DreER小鼠模型。隨后通過(guò)Kit–2A-Cre;R26–GFP，Tnnt2–DreER;R26–rox–tdTomato交配，利用Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組系統(tǒng)，將Kit⁺細(xì)胞標(biāo)記為綠色，將心肌細(xì)胞標(biāo)記為紅色，這樣就可以從Kit⁺細(xì)胞中區(qū)別出非心肌細(xì)胞(GFP⁺tdTomat^-)和心肌細(xì)胞(GFP⁺tdTomato⁺)(Fig.3)。

Fig.3 Strategy for labeling of Kit⁺ cells by dual recombinases-based system.

那么GFP⁺tdTomat^-的非心肌細(xì)胞是否會(huì)產(chǎn)生維持GFP⁺tdTomat^-的新生心肌細(xì)胞呢？

在小鼠心肌梗死(MI)兩周前進(jìn)行他莫昔芬誘導(dǎo)，MI四周后進(jìn)行組織采樣檢測(cè)(Fig.4)，觀察發(fā)現(xiàn)GFP⁺tdTomato⁺心肌細(xì)胞分布于梗死及梗死邊緣位置，但是在所有的組織切片中都沒(méi)有觀察到GFP⁺tdTomato^-心肌細(xì)胞，說(shuō)明心肌梗死后Kit⁺非心肌細(xì)胞不參與新生心肌細(xì)胞的生成。

Fig.4 Immunostaining for green fluorescent protein (GFP), tdTomato, and Troponin I(TNNI3) on myocardial infarction (MI) heart sections.

利用Kit–IRES–Cre模型替換Kit-2A-Cre模型重復(fù)該研究(Fig.5)，得到的也是相同的結(jié)果。

Fig.5 Immunostaining for GFP, tdTomato, and TNNI3 on MI heart sections.

本研究將兩個(gè)新的Kit-Cre模型與雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系追蹤策略結(jié)合，追蹤kit在成體心臟中的命運(yùn)，回避了Kit-Cre譜系追蹤問(wèn)題；不同于以前的Kit-Cre模型，新的Kit-Cre模型不存在Kit單倍體不足的問(wèn)題，同時(shí)標(biāo)記所有Kit⁺細(xì)胞及其后代。

本研究解決了已有Kit-Cre模型的兩大缺陷，間接證明了內(nèi)源的Kit⁺CSCs不是成體心臟心肌更新和修復(fù)所必需的。

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