利用Naica數(shù)字PCR平臺(tái)檢測(cè)鯉魚(yú)皰疹病毒

什么是鯉魚(yú)皰疹病毒?

鯉魚(yú)皰疹病毒3（CyHV-3）是一種295kb的雙鏈DNA病毒，是錦鯉皰疹病毒�。↘HVD）的病原體。目前該病毒已經(jīng)蔓延到全世界許多國(guó)家，并被公認(rèn)為鯉魚(yú)和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)重要問(wèn)題。它在錦鯉和鯉魚(yú)養(yǎng)殖中造成大量死亡，經(jīng)常造成80%以上的損失。

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近日，研究人員發(fā)現(xiàn)將該病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中連續(xù)傳代后，病毒能夠通過(guò)突變體外進(jìn)化，并可能導(dǎo)致毒力的喪失或增加。這一研究結(jié)果發(fā)表在知名期刊《Viruses》上（IF= 3.279）。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員將CyHV-3 (KHV-T)分離株在鯉魚(yú)腦(CCB)細(xì)胞中進(jìn)行99次傳代，通過(guò)感染鯉魚(yú)的方式進(jìn)行傳代過(guò)程中病毒毒力的測(cè)定。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)78次CCB傳代后，病毒分離株的毒力明顯低于原株，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在其ORF150處有一個(gè)1363bp的缺失。

整合基因組觀察(IGV)截屏顯示了包含7個(gè)序列樣本大缺失的區(qū)域。每個(gè)水平軌跡對(duì)應(yīng)于映射到KHVJ

參考基因組(AP008984)上的序列。白色區(qū)域表示沒(méi)有讀取，虛線表示刪除邊界。(P78 4次重復(fù)，P99 2次重復(fù)）

但這一現(xiàn)象在0次和第99次傳代中并未檢測(cè)到。針對(duì)這一現(xiàn)象作者用傳統(tǒng)PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。

A圖 :PCR引物位置,1代表覆蓋整個(gè)ORF150引物，2代表缺失序列內(nèi)設(shè)計(jì)的引物.

B圖 :檢測(cè)結(jié)果，1引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為2593bp，2引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為500bp；P0/P78/P99代表傳代次數(shù).

但是由于常規(guī)illumina測(cè)序和PCR擴(kuò)增可能會(huì)受到多種因素的影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果有顯著誤差，特別是對(duì)于拷貝數(shù)非常低的序列的檢測(cè)。因此研究人員又通過(guò)新一代數(shù)字PCR對(duì)該結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

用數(shù)字PCR技術(shù)定量分析缺失和正常的單倍型。(A)分析設(shè)計(jì)的示意圖；(B)預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物大��；

（C-F）數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果，紅色通道反映undeleted和deleted單倍型濃度，藍(lán)色通道代表undeleted單倍型濃度。

研究結(jié)果表明P78確實(shí)存在一個(gè)1363bp的缺失，并且這種缺失很可能與P78的毒力下降或衰減有關(guān)，也許會(huì)成為治療鯉魚(yú)皰疹病毒的潛在靶點(diǎn)，具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探。

該研究中應(yīng)用的數(shù)字PCR檢測(cè)平臺(tái)為法國(guó)Stilla公司的Naica 數(shù)字PCR系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用cutting-edge微流體創(chuàng)新型芯片——Sapphire芯片作為數(shù)字PCR過(guò)程的唯一耗材。樣品通過(guò)毛細(xì)通道網(wǎng)格以30,000個(gè)微滴的形式進(jìn)入2D芯片中，PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)在芯片上實(shí)現(xiàn)。

該平臺(tái)擁有強(qiáng)大的圖像分析技術(shù)和直觀可視的檢測(cè)功能，從而達(dá)到了數(shù)字PCR定量卓越的置信水平，獲得的數(shù)據(jù)真實(shí)可信。并且該系統(tǒng)目前為市面上最簡(jiǎn)單的數(shù)字PCR系統(tǒng)，也是首款可以實(shí)現(xiàn)3熒光通道檢測(cè)的數(shù)字PCR平臺(tái)。

目前，該產(chǎn)品已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究、NIPT研究、液態(tài)活檢、細(xì)胞治療質(zhì)控、用藥及移植監(jiān)控、致病微生物檢測(cè)、食品安全、環(huán)境檢測(cè)、核酸類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量等方面。

而且該研究中還用到由法國(guó)Stilla Technologies公司開(kāi)發(fā)的Gene-π數(shù)字PCR技術(shù)交流平臺(tái)解讀實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。Gene-π作為數(shù)字PCR學(xué)習(xí)交流平臺(tái)，為您全方位解讀數(shù)字PCR技術(shù)，更多數(shù)字PCR技術(shù)可登陸Gene-π數(shù)字PCR學(xué)堂http://www.cycloudbio.com/p/72.html查看。