GAL4系統(tǒng)酵母雙雜交X-α-Gal酵母半乳糖苷酶 (MEL1) 顯色底物使用及保存說(shuō)明

基本描述：
     X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷，CAS：107021-38-5），一種用來(lái)檢測(cè)α-半乳糖苷酶（也稱為蜜二糖酶，α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2.1.22）活性的顯色底物。X-α-Gal的使用，避開雙雜交分析中β-半乳糖苷酶溶液制備和濾膜提升實(shí)驗(yàn)（filter-lift assay）的繁瑣操作，只需直接添加在培養(yǎng)基上，通過(guò)藍(lán)色沉淀的生成與否，即可用來(lái)檢測(cè)雙雜交相互作用。X-α-Gal可用來(lái)區(qū)分腸桿菌科內(nèi)的不同物種以及劃分乳酸菌和雙歧桿菌。組織學(xué)研究中，X-α-Gal還可借助光學(xué)顯微鏡來(lái)檢測(cè)組織的α-半乳糖苷酶活性。
利用α-半乳糖苷酶水解二糖-蜜二糖作為碳源，酵母菌得以正常生長(zhǎng)或進(jìn)行發(fā)酵。釀酒酵母菌內(nèi)，該酶由幾種GAL基因調(diào)控的MEL1基因所編碼。一旦GAL4激活，α-半乳糖苷酶分泌，之后水解培養(yǎng)基上的X-α-Gal，使得菌落產(chǎn)生藍(lán)斑。酵母雙雜交研究用的工程菌包括AH109，PJ69-2A，Y190和Y187。
酵母雙雜交系統(tǒng)重要元件介紹（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）
一、誘餌（the bait）
為了建立GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白，推薦使用質(zhì)粒pGBKT7；
要調(diào)查三元蛋白復(fù)合物，推薦使用含2個(gè)MCS區(qū)域的三雜交載體，能表達(dá)GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白和第二個(gè)感興趣蛋白，在bait和prey蛋白之間發(fā)揮橋梁作用。

二、檢測(cè)蛋白作用的四個(gè)報(bào)告基因
Matchmarker gold系統(tǒng)是采用4個(gè)報(bào)告基因/3個(gè)不同bait識(shí)別序列的雙雜交系統(tǒng)（見(jiàn)圖2）。其采用新型穩(wěn)定的酵母雙雜交抗生素- 金擔(dān)子素Aureobasidin A （AbA）（貨號(hào)：M0129），可有效殺死非抗性克隆，從而大大降低背景克隆生長(zhǎng)。同時(shí)有效縮減假陽(yáng)性，由于人和prey蛋白單獨(dú)將結(jié)合引起假陽(yáng)性都需要識(shí)別3個(gè)不同序列，激活4個(gè)報(bào)告基因的表達(dá)。

4個(gè)報(bào)告基因分別是：1個(gè)AbA抗生素篩選報(bào)告基因，2個(gè)營(yíng)養(yǎng)篩選報(bào)告基因，1個(gè)藍(lán)白斑篩選報(bào)告基因。

1）  AUR1-C
AUR1基因的主要突變版，能夠表達(dá)肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺合成酶（Inositol phosphorylceramide (IPC) synthase）。當(dāng)?shù)鞍装l(fā)生作用促使GAL4轉(zhuǎn)錄激活，AUR1-C基因進(jìn)行表達(dá)。釀酒酵母中此基因的表達(dá)孵育其對(duì)高毒抗生素金擔(dān)子素Aureobasidin A （AbA）的抗性。由于其背景極其低，這一篩選報(bào)告子由于單一的營(yíng)養(yǎng)缺陷報(bào)告子。
2）  HIS3
Y2HGold菌株不能合成組氨酸，從而無(wú)法在缺少這一必須氨基酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。當(dāng)誘餌和誘捕蛋白相互作用，Gal4反應(yīng)性的His3表達(dá)促使細(xì)胞合成組氨酸并能在His缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
3）  ADE2
Y2HGold菌株無(wú)法在不含腺嘌呤的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但當(dāng)兩個(gè)蛋白相互作用，Ade2表達(dá)被活化，細(xì)胞能在Ade缺陷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
4）  MEL1
MEL1編碼α-半乳糖苷酶，存在許多酵母菌內(nèi)的天然表達(dá)蛋白。當(dāng)雙雜交發(fā)生，MEL1表達(dá)和分泌，在底物X-α-Gal（貨號(hào)：M5831-100mg）存在的情況下，酵母菌落變?yōu)樗{(lán)色。
三、三個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)（three different binding sites）
Y2HGold菌株三個(gè)啟動(dòng)子控制4個(gè)報(bào)告基因是不相關(guān)的，除UAS區(qū)域的短蛋白結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合Gal4 DNA-BD。因此，誘捕蛋白（文庫(kù)蛋白或靶蛋白）與UAS內(nèi)部或邊緣的不相關(guān)序列作用（假陽(yáng)性）就會(huì)自動(dòng)被篩查出來(lái)。
 Matchmarker酵母菌株的報(bào)告基因構(gòu)造。Y2HGold中，HIS3，ADE2，MEL1，和AUR1-C報(bào)告基因分別由三個(gè)完全異源的Gal4反應(yīng)啟動(dòng)元件-G1，G2，M1操控。而啟動(dòng)子內(nèi)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)是不同的，雖然每一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與Gal4識(shí)別的17-mer共有序列相關(guān)聯(lián)。
酵母雙雜交系統(tǒng)操作流程（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）
完整的Matchmarker篩選過(guò)程包含以下步驟：
第一步：執(zhí)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)；
第二步：誘餌載體的構(gòu)建及自我激活和毒性檢測(cè)；
第三步：篩選Mate&Plate文庫(kù)
第四步：確認(rèn)和闡釋結(jié)果

X-α-Gal優(yōu)勢(shì)：
避開雙雜交分析中β-半乳糖苷酶溶液制備和濾膜提升實(shí)驗(yàn)（filter-lift assay）的繁瑣操作，只需直接添加在培養(yǎng)基上，通過(guò)藍(lán)色沉淀的生成與否，即可用來(lái)檢測(cè)雙雜交相互作用。

缺點(diǎn)：
成本高
HIS3報(bào)告基因啟動(dòng)后，酵母可以在組氨酸確實(shí)的平板上生長(zhǎng)；ADE2報(bào)告基因啟動(dòng)后，酵母可以在腺嘌呤（adenine）缺失的平板上生長(zhǎng)；lacZ和MEL1報(bào)告基因是平行的，兩個(gè)基因上游都是由MEL1 UAS和MEL1 TATA區(qū)域同時(shí)控制的，區(qū)別在于lacZ的產(chǎn)物是β-半乳糖苷酶，其底物是X-gal；而MEL1的產(chǎn)物是a-半乳糖苷酶，其底物是X-a-gal�？紤]到成本，我們可以在LWH平板中加入X-gal來(lái)進(jìn)行篩選，其效果與X-a-gal是相同的。因此由三種UAS共同調(diào)控的AH109系統(tǒng)可以較好地排除假陽(yáng)性，并且也能檢測(cè)結(jié)合強(qiáng)弱。

X-α-Gal與酵母雙雜交系統(tǒng)：
酵母雙雜交篩選是體內(nèi)用來(lái)檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的一種遺傳分析實(shí)驗(yàn)，此方法由Prof. Stan Fields及合作者開發(fā)用來(lái)調(diào)查兩個(gè)已知蛋白的相互作用，另一個(gè)重要應(yīng)用是從文庫(kù)內(nèi)篩選并鑒定某一特定蛋白的未知結(jié)合蛋白。陽(yáng)性克隆也就是那些能夠激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄子，使得營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母雙雜交菌株在營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落。大多數(shù)雙雜交方法使用大腸桿菌的LacZ基因作為第二個(gè)報(bào)告基因，通常要使用非常耗時(shí)的filter-lift assay來(lái)鑒定能在第二種選擇性平板上生長(zhǎng)的菌落。而替換使用的X-α-Gal，可直接在營(yíng)養(yǎng)缺陷性的選擇培養(yǎng)基上來(lái)檢測(cè)基于GAL4-轉(zhuǎn)錄子的雙雜交作用。
基本特性：
1）CAS NO：107021-38-5
2）化學(xué)名：5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷；X-α-D-Galactoside X-α-D-半乳糖苷；
3）分子式：C14H15BrClNO6
4）   分子量：408.64g/mol
5）   純度：≥98%（TLC）
6）   外觀：白色或近白色結(jié)晶粉末。
運(yùn)輸與保存方法
冰袋運(yùn)輸。-20 ºC保存。
攜帶MEL1基因的酵母菌株：
    Y2HGold、Y190、AH190、Y187、PG69-2A
X-Gal與X-α-gal不同：
    X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶（LacZ）的反應(yīng)底物，而X-α-gal是酵母α-半乳糖苷酶（MEL1）的反應(yīng)底物。X-α-gal用作酵母雙雜交系統(tǒng)中藍(lán)白篩選的篩選標(biāo)記。
http://www.warbio.cn/rczp/show-1078.html