抗體篩選技術(shù)匯總

瀏覽次數(shù)：7327　發(fā)布日期：2019-9-20　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

近年來(lái)，生物藥的市場(chǎng)需求逐年擴(kuò)容，其中抗體藥物因其靶向性好，治療效果顯著，在生物藥中占據(jù)著舉足輕重的地位，目前已經(jīng)進(jìn)入了抗體藥物發(fā)展的黃金時(shí)代。隨著抗體藥的需求越來(lái)越大，抗體篩選技術(shù)的發(fā)展也是日新月異，目前應(yīng)用較普遍的有雜交瘤技術(shù)、抗體文庫(kù)篩選技術(shù)、納米抗體技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠抗體篩選技術(shù)。其中抗體文庫(kù)篩選又分為噬菌體展示篩選技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)和mRNA展示篩選技術(shù)。接下來(lái)，小編帶大家一起來(lái)了解一下這些抗體篩選技術(shù)。

雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體

1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無(wú)限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開(kāi)創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診斷、預(yù)防和治療提供了新的方法。單克隆抗體，是由單一B細(xì)胞產(chǎn)生的高度均一、識(shí)別特定抗原表位的抗體。

Fig1 單克隆抗體制備^[1]

許多治療性單克隆抗體已廣泛用于腫瘤、自身免疫和感染等疾病的治療^[2]，單克隆抗體在臨床疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用，其主要的作用機(jī)理如圖2所示^[3]，基于單克隆抗體的抗體藥是目前治療多種疾病的有效方法。

Fig2 單克隆抗體的分類及作用機(jī)理

噬菌體展示篩選技術(shù)

2018年10月3日George Smith教授因其在噬菌體展示相關(guān)研究方面的貢獻(xiàn)獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，近年來(lái)，噬菌體展示技術(shù)正被廣泛用于抗體藥物的研發(fā)，已有大量的上市藥物被批準(zhǔn)使用，其原理為將B淋巴細(xì)胞的抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的片段插入到噬菌體載體中，抗體分子Fab片段或者單鏈抗體（scFv）與單鏈?zhǔn)删w外殼蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，再將噬菌體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖，待成熟后釋放出來(lái)，最后利用抗原篩選的方法經(jīng)過(guò)親和吸附-洗脫-擴(kuò)增等步驟后即可獲得靶抗原特異性的單克隆噬菌體抗體^[4]。

Fig3 噬菌體展示技術(shù)

酵母表面展示技術(shù)

酵母表面展示技術(shù)原理為將外源蛋白基因與特定的載體基因融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，融合蛋白含有可錨定在酵母細(xì)胞壁上的結(jié)構(gòu)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯后可將外源蛋白固定化表達(dá)在酵母細(xì)胞表面，圖4顯示為采用酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)篩選抗體。酵母表面展示技術(shù)作為真核展示系統(tǒng)，已逐漸成為現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域一種十分有效的展示技術(shù)，在許多方面得到了廣泛的應(yīng)用^[5]。

Fig4酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)^[6]

核糖體展示與mRNA展示篩選技術(shù)

1997年，Pluckthun實(shí)驗(yàn)室建立了體外篩選完整功能蛋白的新技術(shù)-核糖體展示技術(shù)，其主要流程為，首先構(gòu)建核糖體展示的DNA模板，然后依次體外轉(zhuǎn)錄、體外翻譯和親和篩選。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA不含任何終止密碼，在體外翻譯過(guò)程中核糖體會(huì)停留在mRNA的3'末端，使目的基因的翻譯產(chǎn)物展示在核糖體表面，并形成mRNA-蛋白質(zhì)-核糖體”三元復(fù)合體, 采用洗脫緩沖液使核糖體解離，釋放mRNA，后者經(jīng)過(guò)純化后用作RT-PCR的模板，重新引入核糖體展示的各種必需元件、進(jìn)行下一循環(huán)的富集和選擇，最終篩選出高親和力的目標(biāo)分子^[7]。核糖體展示技術(shù)在細(xì)胞外進(jìn)行，可獲得大容量庫(kù)（10¹¹-10¹³），篩選周期短，操作簡(jiǎn)單，結(jié)合體外突變技術(shù)可篩選出新功能的高活性蛋白^[8]。

mRNA展示技術(shù)又稱mRNA-蛋白質(zhì)融合體展示技術(shù)，是一種新興的體外多肽篩選技術(shù)，其與核糖體展示技術(shù)原理類似，小編這里就不作贅述了。目前，mRNA展示技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，成為體外蛋白質(zhì)篩選和定向進(jìn)化的有力工具，在生物技術(shù)、醫(yī)藥衛(wèi)生和蛋白質(zhì)組學(xué)等多個(gè)方面有很好的應(yīng)用前景。

Fig5 核糖體展示篩選技術(shù)^[9]

納米抗體（Nanobody, Nb）篩選方法

納米抗體的制備是從駱駝體內(nèi)分離出重鏈抗體(Heavy chain antibodies , HCAbs)。提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得模板，根據(jù)重鏈抗體保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR法擴(kuò)增獲得全套重鏈抗體可變區(qū)基因(Viriable domain ofheavy chain of heavy-chain antibody, VHH)，而后將其克隆至載體，體外表達(dá)獲得含有多種單價(jià) Nb的抗體庫(kù)。應(yīng)用特定抗原從Nb庫(kù)中經(jīng)過(guò)多次淘選即可得到抗原特異性的Nb。Nb庫(kù)的構(gòu)建較為簡(jiǎn)單、有效、僅用一對(duì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增就可以獲得駱駝重鏈抗體的全套VHH基因，經(jīng)過(guò)3-4輪富集篩選后即可分析單個(gè)克隆以獲得目的抗體。Nb源于天然缺失輕鏈的重鏈抗體，天然存在，穩(wěn)定性和可溶性更強(qiáng)；且具有很強(qiáng)的抗原結(jié)合能力，特異性較強(qiáng)^[10]。

Fig6 納米抗體篩選方法

轉(zhuǎn)基因小鼠全人源抗體篩選技術(shù)

20世紀(jì)90年代中期以后，利用人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)技術(shù)和抗體庫(kù)平臺(tái)技術(shù)開(kāi)發(fā)的全人源抗體逐漸占據(jù)了抗體藥物研發(fā)的主導(dǎo)地位，使抗體工程技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展階段-全人源抗體階段。轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人源抗體的實(shí)驗(yàn)原理是:采用基因編輯技術(shù)將小鼠Ig基因替換為人Ig基因，然后用抗原免疫小鼠，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)即可大量生產(chǎn)人源化抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)平臺(tái)已經(jīng)成功地作為一個(gè)創(chuàng)新全人源單抗藥物以及常用靶點(diǎn)升級(jí)抗體藥物的來(lái)源。轉(zhuǎn)基因小鼠的研發(fā)周期長(zhǎng)，風(fēng)險(xiǎn)高，但其對(duì)抗體藥物篩選的意義是巨大的，因此對(duì)其進(jìn)行深入研究是非常有前景的，同時(shí)也是必要的^[11]。

好了，小編就給大家介紹到這里了，如果有興趣，歡迎與我們共同探討。

依托于基因編輯，海門動(dòng)物中心和藥理藥效服務(wù)平臺(tái)，百奧賽圖于2016年正式成立新藥研發(fā)服務(wù)平臺(tái)，同時(shí)，通過(guò)將小鼠重鏈和k輕鏈基因原位置換為人抗體基因（Mb級(jí)），百奧賽圖于2019年初成功制備了全新小鼠研究模型-RenMab Mouse，通過(guò)它，我們可以直接在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生全人單克隆抗體，大大節(jié)省了鼠源抗體的改造時(shí)間，如有興趣，歡迎隨時(shí)咨詢偶~