酵母雙雜交檢測（Yeast Two-Hybrid Assay）的原理及應(yīng)用

檢測原理：
       酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid assay）是用于體內(nèi)研究蛋白相互作用的一種非常便利的工具，常用的如GAL4為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，使用酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4來檢測轉(zhuǎn)錄激活后的蛋白相互作用。某些轉(zhuǎn)錄因子（如GAL4）由兩個可以分開，功能上相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成，N端有一個147個氨基酸組成的DNA結(jié)合域（DNA binding domain，BD），C端有一個由113個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域（transcription activation domain，AD）。BD可以和上游激活序列（UAS）結(jié)合，而AD能激活UAS下游基因進行轉(zhuǎn)錄。單獨的BD或AD不能激活基因轉(zhuǎn)錄，兩者只有通過某種方式結(jié)合在一起形成完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的功能。酵母雙雜交系統(tǒng)主要利用酵母GAL4的這個特性通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結(jié)合及對報告基因的轉(zhuǎn)錄激活來研究活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱、瞬間的作用都能通過報告基因敏感的檢測到。
酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用：
對新的與已經(jīng)蛋白相互作用的鑒定
對預(yù)測蛋白相互作用的確認
對蛋白相互作用區(qū)域的鑒定

酵母雙雜交系統(tǒng)重要元件介紹（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）
一、誘餌（the bait）
為了建立GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白，推薦使用質(zhì)粒pGBKT7；
要調(diào)查三元蛋白復(fù)合物，推薦使用含2個MCS區(qū)域的三雜交載體，能表達GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白和第二個感興趣蛋白，在bait和prey蛋白之間發(fā)揮橋梁作用。

二、檢測蛋白作用的四個報告基因
Matchmarker gold系統(tǒng)是采用4個報告基因/3個不同bait識別序列的雙雜交系統(tǒng)。其采用新型穩(wěn)定的酵母雙雜交抗生素- 金擔(dān)子素Aureobasidin A （AbA）（貨號：M0129），可有效殺死非抗性克隆，從而大大降低背景克隆生長。同時有效縮減假陽性，由于人和prey蛋白單獨將結(jié)合引起假陽性都需要識別3個不同序列，激活4個報告基因的表達。
4個報告基因分別是：1個AbA抗生素篩選報告基因，2個營養(yǎng)篩選報告基因，1個藍白斑篩選報告基因。

1）  AUR1-C
AUR1基因的主要突變版，能夠表達肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺合成酶（Inositol phosphorylceramide (IPC) synthase）。當(dāng)?shù)鞍装l(fā)生作用促使GAL4轉(zhuǎn)錄激活，AUR1-C基因進行表達。釀酒酵母中此基因的表達孵育其對高毒抗生素金擔(dān)子素Aureobasidin A （AbA）的抗性。由于其背景極其低，這一篩選報告子由于單一的營養(yǎng)缺陷報告子。
2）  HIS3
Y2HGold菌株不能合成組氨酸，從而無法在缺少這一必須氨基酸的培養(yǎng)基上生長。當(dāng)誘餌和誘捕蛋白相互作用，Gal4反應(yīng)性的His3表達促使細胞合成組氨酸并能在His缺陷培養(yǎng)基上生長。
3）  ADE2
Y2HGold菌株無法在不含腺嘌呤的基本培養(yǎng)基上生長，但當(dāng)兩個蛋白相互作用，Ade2表達被活化，細胞能在Ade缺陷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長。
4）  MEL1
MEL1編碼α-半乳糖苷酶，存在許多酵母菌內(nèi)的天然表達蛋白。當(dāng)雙雜交發(fā)生，MEL1表達和分泌，在底物X-α-Gal（貨號：M5831-100mg）存在的情況下，酵母菌落變?yōu)樗{色。

三、三個不同的結(jié)合位點（three different binding sites）
Y2HGold菌株三個啟動子控制4個報告基因是不相關(guān)的，除UAS區(qū)域的短蛋白結(jié)合位點特異性結(jié)合Gal4 DNA-BD。因此，誘捕蛋白（文庫蛋白或靶蛋白）與UAS內(nèi)部或邊緣的不相關(guān)序列作用（假陽性）就會自動被篩查出來。
 Matchmarker酵母菌株的報告基因構(gòu)造。Y2HGold中，HIS3，ADE2，MEL1，和AUR1-C報告基因分別由三個完全異源的Gal4反應(yīng)啟動元件-G1，G2，M1操控。而啟動子內(nèi)的蛋白結(jié)合位點是不同的，雖然每一個結(jié)合位點與Gal4識別的17-mer共有序列相關(guān)聯(lián)。
酵母雙雜交系統(tǒng)操作流程（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）
完整的Matchmarker篩選過程包含以下步驟：
第一步：執(zhí)行對照實驗；
第二步：誘餌載體的構(gòu)建及自我激活和毒性檢測；
第三步：篩選Mate&Plate文庫
第四步：確認和闡釋結(jié)果
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