免疫印跡Western bloting實(shí)驗(yàn)原理

免疫印跡Western bloting
    這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體（NC、PVDF膜），并以特異性抗體作為探針檢測之�？贵w與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行定性、分析。

材料（MATERIALS）
o  試劑（REAGENTS）
1.0 M Tris-Hcl（PH6.8）
1.5 M Tris-HCl（PH8.8） 
10% AP（不要配太多）
10% SDS
30% Acr
20% Tween20
10 mM PMSF
0.2 M NaH2PO4
0.2 M Na2HPO4
TBST
轉(zhuǎn)移膜
化學(xué)發(fā)光試劑
轉(zhuǎn)移緩沖液（TB buffer）
電泳緩沖液（EB buffer）
PBS緩沖液
10×麗春紅染液
封閉液（5% 脫脂牛奶）
濾紙
SDS 上樣緩沖液
o  實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
裂解液中加入終濃度為1 mM的PMSF，離心機(jī)預(yù)冷，PBS預(yù)冷，TB buffer 4℃預(yù)冷，
o  器械（EQUIPMENT）
垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、高速離心機(jī)、分光光度計(jì)、脫色搖床、搪瓷盤、蛋白電泳裝置、勻漿器
實(shí)驗(yàn)步驟（PROCEDURE）
蛋白樣品制備 預(yù)計(jì)時長：1h

(一)  貼壁細(xì)胞總蛋白的提�。�
1.   按1 ml裂解液加10μl PMSF（100 mM）混勻后置于冰上。
2.   吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，用4℃預(yù)冷的PBS洗兩次后，根據(jù)細(xì)胞數(shù)目加入相應(yīng)體積的裂解液搖勻于冰上裂解30 min（60 mm皿加1 ml）期間可搖動混勻。
3.   裂解完成后，用槍頭將細(xì)胞刮掉然后轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中。
4.   2-3步也可為：加入裂解液靜置兩分鐘后刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中，用超聲破碎細(xì)胞。
5.   12000 g × 5 min 4℃離心后，轉(zhuǎn)移至新的EP管中。
6.   -20℃保存或進(jìn)行下一步。

(二)  懸浮細(xì)胞總蛋白的提取
1.      將培養(yǎng)基倒至15 ml離心管中，800 g × 5 min 4℃離心，吸出培養(yǎng)基，加入2 ml 4℃預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞后再次800 g × 10 min 4℃離心，盡量吸干PBS，加入裂解液冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。 
2.      將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起12000 g × 5 min 4℃離心，取上清于1.5 ml離心管中并置于－20℃保存或進(jìn)行下一步。

(三)  組織中總蛋白的提取
1.      將組織塊盡量剪碎，加入含PMSF的裂解液于勻漿器中，進(jìn)行勻漿然后置于冰上。
2.      幾分鐘后，再次勻漿，置于冰上。如此反復(fù)幾次使組織盡量碾碎。
3.      裂解30 min后，將裂解液移至1.5 ml EP管 中，12000 g × 5 min 4℃離心，取上清于1.5 ml離心管中并置于－20℃保存或進(jìn)行下一步。
蛋白質(zhì)定量
一般選擇BCA或者Bradford方法，具體方法見各試劑盒說明書。BCA要求檢測波長為562 nm，Bradford為595 nm。為避免假陽性結(jié)果，建議先把lysis buffer加入BCA工作液或考馬斯G250混合看是否產(chǎn)生顏色。具體測完蛋白含量后，計(jì)算含50-100 ug蛋白的溶液體積即為上樣量（一般8cm寬的迷你膠每個泳道最大能承載的蛋白質(zhì)量為150ug）。

(一)  制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
1.      從-20℃取出1 mg/ml BSA，室溫融化后，備用。
2.      取18個1.5 ml離心管，3個一組，分別標(biāo)記為0 μg，2.5 μg，5.0 μg，10.0 μg，20.0 μg，40.0 μg。
3.      按下表在各管中加入各種試劑。

	0 μg	2.5 μg	5 μg	10 μg	20 μg	40 μg
1 mg/ml BSA		2.5μl	5μl	10μl	20μl	40μl
0.15 M NaCl	100μl	97.5μl	95μl	90μl	80μl	60μl
G250 溶液	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml

4.      混勻后，室溫放置2 min。在生物分光光度計(jì)上比色分析。

(二)  檢測樣品蛋白含量
1.   取足量的1.5 ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml。室溫放置30 min后即可用于測蛋白。
2.   取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 M NaCl 100μl，混勻放置2 min 可作為空白樣品，將空白倒入比色皿中做好的標(biāo)準(zhǔn)曲線程序下按Blank測空白樣品。
3.   棄空白樣品，用無水乙醇清洗bisemin2次，用無菌水洗一次。
4.   取一管考馬斯亮藍(lán)加95 μl 0.15 M NaCl 溶液和5μl 待測蛋白樣品，混勻后靜置2 min后測量。
SDS-PAGE電泳  預(yù)計(jì)時長：3.5h

（一）灌膠與上樣
1.   玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏液，然后用濾紙將水吸干）。
2.    選擇合適的分離膠濃度配置，注意最后加入TEMED，之后搖勻即可灌膠。此外應(yīng)保證試劑的新鮮，特別是過硫酸銨。灌膠時膠要沿玻璃板流下，否則膠中易有氣泡（濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水或異丙醇，（加水液封時要很慢，否則膠會被沖變形）。注意給濃縮膠留出足夠的空間（推薦長度為插入的梳齒長再加1cm）
3.   當(dāng)水和膠之間有一條折射線時說明膠已凝了，一般需半個小時（氣溫高會快些）。倒去膠上層水或異丙醇并用吸水紙吸干或放倒靜置幾分鐘將水流干。AP不新鮮會導(dǎo)致聚合變慢，必要時可適當(dāng)增加AP以及TEMED的量，但通常不會超過1h
4.   配制濃縮膠，方法與操作同分離膠，將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中，避免膠與梳子之間有氣泡。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補(bǔ)膠至剛剛冒頂。

SDS-PAGE配方

分離膠	15%	12%	10%	8%	6%	濃縮膠	5%
ddH2O	1.76ml	2.64 ml	3.2 ml	4.6 ml	4.24 ml	ddH2O	3.4 ml
30%丙烯酰胺	4ml	3.2 ml	2.64 ml	2.6 ml	1.6 ml	30%丙烯酰胺	0.83 ml
1.5M Tris-Hcl（8.8）	2ml	2 ml	2 ml	2.6 ml	2 ml	1.0M Tris-Hcl（6.8）	0.63 ml
10% SDS	80μL	80μL	80μL	80μL	80μL	10%SDS	50μL
10% APS	80μL	80μL	80μL	80μL	80μL	10%APS	50μL
TEMED	3.2μL	3.2μL	3.2μL	3.2μL	3.2μL	TEMED	5μL

▲關(guān)鍵步驟：
1. 過硫酸銨用量很少，且易變質(zhì)，一次不要配太多，最多不超過兩周。
2. 未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時應(yīng)該戴手套防護(hù)。
（二）上樣、電泳
1.   測完蛋白含量后，計(jì)算含50 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至1.5 ml離心管中，加入5 × SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15 μl，加樣孔的最大限度可加20 μl樣品。）上樣前要將樣品100 ℃ 5 min使蛋白變性。
2.   濃縮膠電泳電壓為110 V，當(dāng)樣品在濃縮膠、分離膠交界處被壓為一條線時，電壓調(diào)為130 V
轉(zhuǎn)膜   預(yù)計(jì)時長：3h
1.   在電泳結(jié)束前20 min開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜所需的東西。轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張的濾紙（長一般為8.1~8.3 cm，寬度根據(jù)裁的膠大小實(shí)際測量，但膠一般會縮水，所以裁8cm就行）和1張NC或PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴干凈手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜�污染膜。PVDF膜使用前用無水甲醇中浸泡1 min-2 min，NC膜不需要。目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。
2.   將玻璃板撬開后，輕輕刮去濃縮膠，用蒸餾水沖洗干凈。取出凝膠后可以在右上角裁一個小角以區(qū)分上下左右。之后有兩種方法供選擇，一是按照marker指示，把含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來，二是把整張膠轉(zhuǎn)膜。
3.   在陶瓷盆中倒入TB buffer，放入浸過甲醇的PVDF膜平衡10 min。帶上手套，將夾子打開使黑的一面平放轉(zhuǎn)移槽的底座，依次在石墨電極上墊一張海綿墊、疊放3張浸泡過緩沖液的濾紙、剛剛完成電泳的凝膠、PVDF膜（此時可在膜右上角減去一個角，以辨明轉(zhuǎn)膜后的蛋白面與非蛋白面）、和另外3張浸泡過緩沖液的濾紙、另一個海綿墊，合起夾子。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。
4.  將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，所以TB Buffer要在4℃預(yù)冷，轉(zhuǎn)移槽要放在冰水混合泡沫箱中。的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h。
5.  轉(zhuǎn)完后將膜用1× 麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖，可回收）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。使用預(yù)染marker話可以看見marker的顏色轉(zhuǎn)印到了膜上，但是憑借這個顏色來判斷是否轉(zhuǎn)印完全或轉(zhuǎn)印過頭是不可靠的。
▲關(guān)鍵步驟：操作是要戴手套，否則手上的蛋白會造成污染。
免疫雜交反應(yīng)  預(yù)計(jì)時長：1 Day
1.  封閉：將膜用TBST浸濕，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h即可，注意封閉后不要洗脫，（如果是自己配置的封閉液，最好過濾一下以消除固體雜質(zhì)）。
2.  一抗孵育： 將一抗用封閉液稀釋（一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用TBST稀釋也可以）至適當(dāng)濃度（可以在5 ml EP管中配置工作液，常用稀釋倍數(shù)為1:1000，具體按抗體說明來，用后可回收重復(fù)用2-3次， -20℃保存，避免反復(fù)凍融）。

一、二抗孵育有兩種方法：
1） 膜孵：撕下適當(dāng)大小的一塊兒封口膜（也可使用保鮮膜）鋪于培養(yǎng)皿蓋上，使封口膜保持平整，將抗體溶液加到封口膜上，從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡，放于濕盒中，室溫孵育1 h或4℃過夜孵育。用TBST在室溫下脫色搖床上洗6×5 min。
2）配制5 ml抗體稀釋液于5 ml EP管中，直接將膜放入，4℃過夜孵育，用TBST在室溫下脫色搖床上洗4×5 min。
3.      二抗孵育： 方法同一抗孵育，但一般二抗稀釋比較大1:10000足夠。用TBST在室溫下脫色搖床上洗4×5min。
化學(xué)發(fā)光  預(yù)計(jì)時長 10min
化學(xué)發(fā)光反應(yīng)：在實(shí)驗(yàn)臺上鋪一張一次性手套，將轉(zhuǎn)移膜放在手套上，蛋白面向上。將化學(xué)發(fā)光的A液和B液兩種試劑在EP管內(nèi)等體積混合（總體積能夠覆蓋住膜就行，注意吸完A液后吸B液要換槍頭，否則整瓶試劑都將報(bào)廢），然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應(yīng)1-2 min后（無需避光），將PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，凝膠圖象分析或X-光片曝光。
X-光片曝光：
1.  將轉(zhuǎn)移膜放在保鮮膜上，把另一側(cè)翻過來蓋在其上，把保鮮膜固定在片夾上。
2.  在暗室中，將配好的顯影液和定影液倒入塑料盆中，打開紅色照明燈，取出X光片，剪成比膜稍大，疊放3-4層后放在膜上，不要再移動X光片，關(guān)上X片夾，計(jì)時2-5 min。（多層膠片的目的是找到最合適的曝光度）
3.  時間完成后，打開片夾，X光片放入顯影液，出現(xiàn)明顯條帶后停止顯影，放入定影液，定影5-10 min至膠片透明。
4.  用水將膠片沖干凈，晾干，觀察結(jié)果。定影液和顯影液可回收，避光室溫放存，但不宜放太久。
▲關(guān)鍵步驟：
1.發(fā)光液的A、B液一定不能相互污染，吸取時一定要注意換槍頭。
2.發(fā)光液配制好后應(yīng)立即使用。
3.暗室中光線很弱，可暗適應(yīng)一段時間在開始實(shí)驗(yàn)，拿膠片的時候避免用指甲滑到，會有劃痕。

附錄
相關(guān)試劑的配制：
1.    封閉液（5% 脫脂牛奶的TBST緩沖液）
脫脂奶粉              5g 
TBST                 100ml 
溶解后4℃保存。使用時，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。如不經(jīng)常用，可每次現(xiàn)用現(xiàn)配所需體積。
2.    TBST緩沖液（含0.05％ Tween20的TBS緩沖液）
20％Tween20        1.65ml             
TBS                700ml              
混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。
3.    TBS緩沖液（100 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl）   
1 M Tris-HCl（pH7.5）  10 ml
NaCl                   8.8g
蒸餾水至               1000ml
4.    10×麗春紅染液 
麗春紅S         2 g
三氯乙酸        30 g
磺基水楊酸      30 g
蒸餾水至        100 ml 
使用時將其稀釋10倍。
5.    轉(zhuǎn)移緩沖液（48 mM Tris，39 mM甘氨酸，0.037％ SDS，20％ 甲醇）
甘氨酸（MW75.07）        2.9g
Tris（MW121.14）          5.8g  
SDS                       0.37g  
甲醇                       200ml
蒸餾水至                   1000ml 
溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用3～5次
6.    電泳液緩沖液（25 mM Tris，0.25 M甘氨酸，0.1％ SDS）               
Tris（MW121.14）           3.03g
甘氨酸（MW75.07）         18.77g 
SDS                        1g
蒸餾水至                    1000ml   
溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用3-5次。
7.    1.74 mg/ml (10 mM) PMSF          
PMSF          0.174 g          
異丙醇         100 ml 
溶解后，分裝于1.5 ml離心管中，－20℃保存。  
8.    10% SDS
SDS                  10 g          
蒸餾水至              100 ml 
50℃水浴下溶解，室溫保存。
如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。  
9.    10% 過硫酸胺（AP） 
過硫酸胺             0.1 g                    
超純水               1.0 ml
溶解后，4℃保存，保存時間為1周。
10.  30% Acr/Bic                
丙稀酰胺（Acr）               29 g 
甲叉雙丙稀酰胺（Bic）         1 g
超純水至                      100 ml 
37℃下溶解后，濾膜過濾，棕色瓶4℃保存。使用時恢復(fù)至室溫且無沉淀。
11.  20% Tween20
Tween20            20 ml
蒸餾水至            100 ml
混勻后，4℃保存。
12.  0.01 M PBS(PH 7.3)
0.2 M NaH2PO4        19ml
0.2 M Na2HPO4        81ml
NaCl                  17g
蒸餾水至               2000 ml
13.  G250 考馬斯亮藍(lán)溶液（測蛋白含量專用）
G250         100 mg
95% 乙醇     50 ml
磷酸          100 ml
蒸餾水至      1000 ml
先用乙醇溶解考馬斯亮藍(lán)染料，再加水和磷酸，混勻后4℃保存。
14.  100 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA            0.1g
0.15 M NaCl     1 ml
溶解后，-20℃保存。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時，用0.15 M NaCl 進(jìn)行100倍稀釋成1mg/ml，-20℃保存。