血漿蛋白結(jié)合率的經(jīng)典測定方法之平衡透析法

藥物在血漿中會(huì)不同程度地與血漿蛋白結(jié)合，其結(jié)合的程度能夠影響藥物的體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄，進(jìn)而會(huì)影響藥物的藥效學(xué)行為。一般來說，藥物在吸收進(jìn)入血液之后，僅游離的藥物能夠到達(dá)作用部位，產(chǎn)生藥理學(xué)活性。平衡透析法是基于藥物結(jié)合的平衡原理來測定藥物游離濃度最常用的方法，也是研究藥物血漿蛋白結(jié)合率的經(jīng)典方法。
研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的重要生理和藥理功能都需要有藥物小分子的參與，藥物小分子通過與蛋白質(zhì)的相互作用可以促進(jìn)或者抑制蛋白質(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)，尤其是藥物與血漿蛋白結(jié)合會(huì)影響到藥物的生物學(xué)活性。因此藥物血漿蛋白結(jié)合率的測定對于藥物研發(fā)較為重要。
1、平衡透析法
藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥物在動(dòng)物體內(nèi)重要的藥理學(xué)參數(shù)之一，影響著藥物體內(nèi)游離濃度進(jìn)而影響藥物的處置過程。高等動(dòng)物藥物血漿蛋白結(jié)合研究已得到長期的發(fā)展。平衡透析法可以測定藥物血漿蛋白結(jié)合率，該法是用透析膜將蛋白質(zhì)溶液與緩沖液分隔開，建立在兩者之間的一種平衡狀態(tài)，只有分子量小的藥物小分子可以通過。透析的動(dòng)力是擴(kuò)散壓，擴(kuò)散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度與膜的厚度、透析的小分子溶質(zhì)在膜兩邊的濃度梯度及透析溫度等因素有關(guān)。平衡透析法能夠直接測出為與蛋白結(jié)合的藥物小分子的數(shù)量，這是分析蛋白與小分子物質(zhì)結(jié)合的關(guān)鍵，從而能夠求出結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合常數(shù)。
2、血漿蛋白結(jié)合率對藥物的作用
各種藥物以一定的比率與血漿蛋白結(jié)合之后，在血漿中會(huì)同時(shí)存在結(jié)合型與游離型兩種類型，游離性藥物具有藥物活性。藥物與血漿蛋白結(jié)合會(huì)成為結(jié)合型藥物，暫時(shí)失去藥理活性，并且儲(chǔ)存于血液中，起到藥庫的作用，對于藥物作用及其維持時(shí)間長短具有重要的意義。一般蛋白結(jié)合率高的藥物體內(nèi)消除慢，作用維持時(shí)間長，藥效平穩(wěn)。結(jié)合率低的藥物體內(nèi)消除快，同時(shí)作用時(shí)間短，藥效有很大的波動(dòng)。
藥物內(nèi)源性性化合物也可在血漿蛋白結(jié)合部位發(fā)生競爭性置換作用，兩種以上的藥物聯(lián)用時(shí)，可相互競爭血漿蛋白的結(jié)合部位，結(jié)合力強(qiáng)的藥物能從蛋白結(jié)合部位上取代結(jié)合力弱的藥物，使后者游離型數(shù)量增加，導(dǎo)致藥效和毒性反應(yīng)亦增強(qiáng)。其影響程度可因后者在體內(nèi)的分布容積不同而異。一般只有血漿蛋白結(jié)合率高，分布容積小，消除慢以及治療指數(shù)低的藥物在臨床上的這種相互作用才有意義。血漿蛋白結(jié)合率測定屬于藥代動(dòng)力學(xué)研究內(nèi)容，美迪西是一家醫(yī)藥研發(fā)外包服務(wù)公司，在藥代動(dòng)力學(xué)體外研究方面有豐富的經(jīng)驗(yàn)，體外研究是指代謝穩(wěn)定性、P450誘導(dǎo)和抑制、代謝途徑研究、代謝產(chǎn)物鑒定等研究項(xiàng)目，涉及的動(dòng)物有大鼠、小鼠、兔、狗、猴子等。
3、平衡透析法測定血漿蛋白結(jié)合率的應(yīng)用
如有研究者利用平衡透析法測定了羊耳菊提取物中9個(gè)成分的血漿蛋白結(jié)合率。研究者采用平衡透析法測定提取物中9個(gè)成分血漿蛋白結(jié)合率，生物樣本用甲醇沉淀蛋白法進(jìn)行處理，再以葛根素為內(nèi)標(biāo)，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜儀串聯(lián)測定血漿及緩沖溶液中的綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、東莨菪苷、1，3-O-二咖啡酰基奎寧酸、3，4-O-二咖啡�；�奎寧酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和4，5-O-二咖啡�；�奎寧酸等9個(gè)成分的濃度^[1]。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所研究濃度范圍內(nèi)，9個(gè)成分呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r≥0.999)，準(zhǔn)確度、精密度、提取回收率和穩(wěn)定性等均符合生物樣品測定要求，且并無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，表明該文所建立的方法穩(wěn)定可靠，可用于羊耳菊藥材中9種成分在人和大鼠血漿中的血漿蛋白結(jié)合率測定。9種成分在人和大鼠血漿中的平均蛋白結(jié)合率分別在(41.07±0.046)%～(94.95±0.008)%，(37.66±0.043)%～(97.46±0.013)%。結(jié)果表明羊耳菊提取物中9個(gè)成分在人和大鼠中的血漿蛋白結(jié)合率存在差異。
還有研究者采用平衡透析法模擬化合物L(fēng)S-177在體內(nèi)與血漿蛋白的結(jié)合過程，采用UPLC-MS/MS方法對透析外液和內(nèi)液中LS-177的含量進(jìn)行測定，計(jì)算LS-177與大鼠、比格犬和人的血漿蛋白結(jié)合率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所建立的LS-177蛋白結(jié)合率測定方法簡便、穩(wěn)定、可靠，LS-177血漿蛋白結(jié)合率不具有明顯的濃度依賴性和種屬差異。
平衡透析法在測定藥物血漿蛋白結(jié)合率具有操作簡單、溫度易于控制、PH值可調(diào)、設(shè)備成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。但是同時(shí)存在達(dá)成平衡時(shí)間較長、溶液體積會(huì)變化，且透析時(shí)間過長可能會(huì)造成由加熱或代謝引起的被測物質(zhì)的降解等缺點(diǎn)。因此在利用平衡透析法測定藥物血漿蛋白結(jié)合率，或者藥物與蛋白質(zhì)相互作用時(shí)需要與其他的一些方法聯(lián)用，才能獲得更準(zhǔn)確的作用信息。
[1]平衡透析法測定羊耳菊提取物中9個(gè)成分的血漿蛋白結(jié)合率[J].