新型冠狀病毒2019-nCoV及SARS入侵宿主途徑解析
2019-nCoV和SARS疫戰(zhàn)中的特洛伊木馬—ACE2
2019-nCoV襲來，擾亂了很多人的“原計劃”，不禁讓人回想起2003年的“SARS非典疫情”（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS），以及肆虐中東地區(qū)的中東呼吸綜合癥MERS（Middle East Respiratory Syndrome，MERS）。以上兩種疫病的爆發(fā)均與冠狀病毒有關。
那么冠狀病毒到底是什么呢？
冠狀病毒直徑約60-220nm，病毒內(nèi)包含正向的單鏈RNA，單鏈的RNA長度約27到32kb，分為兩大組成部分：復制酶編碼區(qū)和結構蛋白編碼區(qū)。
復制酶編碼區(qū)主要表達編碼兩個大基因，ORF1a和ORF1b，它們編碼16個非結構蛋白（nsp1-nsp16），在整個冠狀病毒中高度保守（圖1A）。結構蛋白編碼區(qū)主要編碼冠狀病毒四個結構蛋白：刺突糖蛋白（Spike Protein，S），是受體結合位點；包膜糖蛋白（Envelope Protein，E），幫助病毒進入宿主細胞；膜糖蛋白（Membrane glycoprotein，M），負責營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運輸、新生病毒的出芽釋放；核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N），保護RNA的穩(wěn)定性[1]（圖1B） 。
改自Cui J, Li F, Shi ZL (2019). Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nat Rev Microbio. 17(3):181-192.
冠狀病毒是如何入侵宿主細胞的呢？
以SARS-CoV為例，SARS-CoV表面的Spike蛋白由與受體結合的S1亞基和介導膜融合的S2跨膜結構域組成，S1亞基中的受體結合區(qū)（Receptor Binding Domain, RBD) 結構域與粘膜細胞表面的受體血管緊張素轉換酶2（Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2）結合，促使SARS-CoV進入宿主細胞（圖2），隨后暴露病毒RNA，翻譯出病毒RNA復制酶，形成RNA復制酶-轉錄酶復合物。這種復合物通過復制和轉錄來形成RNA負鏈，在轉錄過程中，通過不連續(xù)轉錄產(chǎn)生7-9個RNA的子集，包括編碼所有結構蛋白的RNA，翻譯成病毒的結構蛋白。細胞質(zhì)中的RNA和結構蛋白組裝成新的病毒顆粒，經(jīng)胞吐作用從被感染的細胞中釋放出來，以感染新的細胞，由此逐漸蔓延至支氣管，肺部（圖3）。在這個過程中，ACE2就像是特洛伊木馬，幫助SARS-CoV進入人體。
Nature雜志2020年2月3日分別發(fā)表了武漢病毒所石正麗團隊和復旦大學公共衛(wèi)生學院張永振團隊的最新研究結果：如今橫行的2019-nCoV與SARS-CoV之間的核苷酸相似性達到89.1％[2]，且與SARS-CoV使用相同的細胞受體ACE2進入細胞[3]。
ACE2在胃腸道，心臟，腎臟，肺，睪丸和大腦中表達，蛋白大小約120KD。ACE2能夠作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)（該系統(tǒng)能維持人體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，但是過表達會導致血壓、水、電解質(zhì)的失衡）的負調(diào)節(jié)劑以保護心血管系統(tǒng)，也能在腎臟和腸道的氨基酸吸收中發(fā)揮功能，還對減少中風起積極作用[4, 5]。2003年，SARS-CoV肆虐中國以后，科學家們很快解析到ACE2是SARS-CoV進入細胞的受體[6]，隨后關于ACE2和SARS-CoV相互作用的研究從未停止過。
中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室的蔣澄宇教授團隊對小鼠進行PAMAM納米顆粒誘導肺損傷實驗中發(fā)現(xiàn)，Ace2基因敲除的小鼠，肺損傷加劇，這表明Ace2在肺功能中發(fā)揮重要作用[7]。
Iowa大學的Stanley Perlman團隊，構建了由人類細胞角蛋白18（Cytokeratin 18，K18）啟動子調(diào)控的人源基因ACE2表達的轉基因小鼠，K18-hACE2感染SARS-CoV4天后的肺泡中檢測到病毒抗原，而野生型小鼠感染病毒后肺泡中并未檢測到病毒抗原[8, 9]。
2016年North Carolina大學的Ralph S. Baric教授團隊發(fā)表在PNAS上的一篇文章也證明了小鼠體內(nèi)過表達人源ACE2表現(xiàn)出對SARS-CoV和WIV1-CoV（以SARS-CoV為模板構造的傳染性相對較弱的CoV，受體依然為ACE2，但是實驗小鼠的死亡率降低，能獲得更多臨床前數(shù)據(jù))的易感，該團隊創(chuàng)制了由肺纖毛上皮細胞啟動子HFH4啟動人源ACE2基因的轉基因小鼠，HFH4-hACE2小鼠中ACE2并沒有表現(xiàn)出預期的肺部特異表達，在腦，肝，腎和胃腸道中也檢測到不同程度的表達。所有感染SARS-CoV的HFH4-ACE2小鼠的體重減輕了20％以上，并在肺和腦中檢測到SARS-CoV強大的復制能力，而在感染W(wǎng)IV1-CoV7天后體重減輕> 10％的小鼠在大腦中檢測到大量的病毒復制，但在肺中的復制明顯降低，體重減輕<10％小鼠的肺和腦中的病毒復制較低，且產(chǎn)生了足夠的適應性免疫應答以清除病毒并在感染后存活。該團隊還找到一種單克隆抗體227.14，能夠保護HFH4-ACE2小鼠免受致命的SARS-CoV 和WIV-CoV攻擊，經(jīng)抗體治療后，HFH4-ACE2小鼠肺中均未檢測到病毒[10]（圖4）。
如何駕馭這個特洛伊木馬、什么樣的ACE2動物模型更適合做臨床前研究還需要進一步探討。希望ACE2能夠成為治療SARS和2019-nCoV病毒的突破口，早日找到有效的治療方法，造福人類。
[1] Jiang S. et al (2019). The spike protein of SARS-CoV—a target for vaccine and therapeutic development. Nat Rev Microbiol. 7:226-36.
[2] Wu, F. et al (2020). A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature https://doi. org/10.1038/s41586-020-2008-3.
[3] Zhou P. et al (2020). A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7.
[4] Alenina N, Bader M (2019). ACE2 in Brain Physiology and Pathophysiology: Evidence from Transgenic Animal Models. Neurochem Res. 44:1323-1329.
[5] Kuba K et al., (2010). Trilogy of ACE2: A peptidase in the renin–angiotensin system, a SARS receptor, and a partner for amino acid transporters. Pharmacol Ther. 128(1):119-28.
[6] Li W et al., (2003). Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 426(6965):450-4.
[7] Sun Y, Guo F, Zou Z, Li C, Hong X, Zhao Y, Wang C, Wang H, Liu H, Yang P, Han Z, Liu K, Kuba K, Song B, Gao J, Mo Z, Li D, Li B, Li Q, Zhong N, Wang C, Penninger JM, Jiang C (2015). Cationic nanoparticles directly bind angiotensin-converting enzyme 2 and induce acute lung injury in mice. Part Fibre Toxicol. 7;12:4.
[8] Perlman S. et al (2007). Lethal infection of K18-hACE2 mice infected with severe acute respiratory syndrome coronavirus. J Virol. 81(2):813-21.
[9]NetlandJ.etal(2008).Severe acute respiratory syndrome coronavirus infection causes neuronal death in the absence of encephalitis in mice transgenic for human ACE2. J Virol. 82(15):7264-75.
[10] Menachery VD, et al. (2016). SARS-like WIV1-CoV poised for human emergence. Proc Natl Acad Sci USA. 113(11):3048-53.
2019-nCoV襲來，擾亂了很多人的“原計劃”，不禁讓人回想起2003年的“SARS非典疫情”（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS），以及肆虐中東地區(qū)的中東呼吸綜合癥MERS（Middle East Respiratory Syndrome，MERS）。以上兩種疫病的爆發(fā)均與冠狀病毒有關。
那么冠狀病毒到底是什么呢？
冠狀病毒直徑約60-220nm，病毒內(nèi)包含正向的單鏈RNA，單鏈的RNA長度約27到32kb，分為兩大組成部分：復制酶編碼區(qū)和結構蛋白編碼區(qū)。
復制酶編碼區(qū)主要表達編碼兩個大基因，ORF1a和ORF1b，它們編碼16個非結構蛋白（nsp1-nsp16），在整個冠狀病毒中高度保守（圖1A）。結構蛋白編碼區(qū)主要編碼冠狀病毒四個結構蛋白：刺突糖蛋白（Spike Protein，S），是受體結合位點；包膜糖蛋白（Envelope Protein，E），幫助病毒進入宿主細胞；膜糖蛋白（Membrane glycoprotein，M），負責營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運輸、新生病毒的出芽釋放；核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N），保護RNA的穩(wěn)定性[1]（圖1B） 。
冠狀病毒是如何入侵宿主細胞的呢？
以SARS-CoV為例，SARS-CoV表面的Spike蛋白由與受體結合的S1亞基和介導膜融合的S2跨膜結構域組成，S1亞基中的受體結合區(qū)（Receptor Binding Domain, RBD) 結構域與粘膜細胞表面的受體血管緊張素轉換酶2（Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2）結合，促使SARS-CoV進入宿主細胞（圖2），隨后暴露病毒RNA，翻譯出病毒RNA復制酶，形成RNA復制酶-轉錄酶復合物。這種復合物通過復制和轉錄來形成RNA負鏈，在轉錄過程中，通過不連續(xù)轉錄產(chǎn)生7-9個RNA的子集，包括編碼所有結構蛋白的RNA，翻譯成病毒的結構蛋白。細胞質(zhì)中的RNA和結構蛋白組裝成新的病毒顆粒，經(jīng)胞吐作用從被感染的細胞中釋放出來，以感染新的細胞，由此逐漸蔓延至支氣管，肺部（圖3）。在這個過程中，ACE2就像是特洛伊木馬，幫助SARS-CoV進入人體。
Nature雜志2020年2月3日分別發(fā)表了武漢病毒所石正麗團隊和復旦大學公共衛(wèi)生學院張永振團隊的最新研究結果：如今橫行的2019-nCoV與SARS-CoV之間的核苷酸相似性達到89.1％[2]，且與SARS-CoV使用相同的細胞受體ACE2進入細胞[3]。
ACE2在胃腸道，心臟，腎臟，肺，睪丸和大腦中表達，蛋白大小約120KD。ACE2能夠作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)（該系統(tǒng)能維持人體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，但是過表達會導致血壓、水、電解質(zhì)的失衡）的負調(diào)節(jié)劑以保護心血管系統(tǒng)，也能在腎臟和腸道的氨基酸吸收中發(fā)揮功能，還對減少中風起積極作用[4, 5]。2003年，SARS-CoV肆虐中國以后，科學家們很快解析到ACE2是SARS-CoV進入細胞的受體[6]，隨后關于ACE2和SARS-CoV相互作用的研究從未停止過。
中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室的蔣澄宇教授團隊對小鼠進行PAMAM納米顆粒誘導肺損傷實驗中發(fā)現(xiàn)，Ace2基因敲除的小鼠，肺損傷加劇，這表明Ace2在肺功能中發(fā)揮重要作用[7]。
Iowa大學的Stanley Perlman團隊，構建了由人類細胞角蛋白18（Cytokeratin 18，K18）啟動子調(diào)控的人源基因ACE2表達的轉基因小鼠，K18-hACE2感染SARS-CoV4天后的肺泡中檢測到病毒抗原，而野生型小鼠感染病毒后肺泡中并未檢測到病毒抗原[8, 9]。
2016年North Carolina大學的Ralph S. Baric教授團隊發(fā)表在PNAS上的一篇文章也證明了小鼠體內(nèi)過表達人源ACE2表現(xiàn)出對SARS-CoV和WIV1-CoV（以SARS-CoV為模板構造的傳染性相對較弱的CoV，受體依然為ACE2，但是實驗小鼠的死亡率降低，能獲得更多臨床前數(shù)據(jù))的易感，該團隊創(chuàng)制了由肺纖毛上皮細胞啟動子HFH4啟動人源ACE2基因的轉基因小鼠，HFH4-hACE2小鼠中ACE2并沒有表現(xiàn)出預期的肺部特異表達，在腦，肝，腎和胃腸道中也檢測到不同程度的表達。所有感染SARS-CoV的HFH4-ACE2小鼠的體重減輕了20％以上，并在肺和腦中檢測到SARS-CoV強大的復制能力，而在感染W(wǎng)IV1-CoV7天后體重減輕> 10％的小鼠在大腦中檢測到大量的病毒復制，但在肺中的復制明顯降低，體重減輕<10％小鼠的肺和腦中的病毒復制較低，且產(chǎn)生了足夠的適應性免疫應答以清除病毒并在感染后存活。該團隊還找到一種單克隆抗體227.14，能夠保護HFH4-ACE2小鼠免受致命的SARS-CoV 和WIV-CoV攻擊，經(jīng)抗體治療后，HFH4-ACE2小鼠肺中均未檢測到病毒[10]（圖4）。
如何駕馭這個特洛伊木馬、什么樣的ACE2動物模型更適合做臨床前研究還需要進一步探討。希望ACE2能夠成為治療SARS和2019-nCoV病毒的突破口，早日找到有效的治療方法，造福人類。
[1] Jiang S. et al (2019). The spike protein of SARS-CoV—a target for vaccine and therapeutic development. Nat Rev Microbiol. 7:226-36.
[2] Wu, F. et al (2020). A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature https://doi. org/10.1038/s41586-020-2008-3.
[3] Zhou P. et al (2020). A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7.
[4] Alenina N, Bader M (2019). ACE2 in Brain Physiology and Pathophysiology: Evidence from Transgenic Animal Models. Neurochem Res. 44:1323-1329.
[5] Kuba K et al., (2010). Trilogy of ACE2: A peptidase in the renin–angiotensin system, a SARS receptor, and a partner for amino acid transporters. Pharmacol Ther. 128(1):119-28.
[6] Li W et al., (2003). Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 426(6965):450-4.
[7] Sun Y, Guo F, Zou Z, Li C, Hong X, Zhao Y, Wang C, Wang H, Liu H, Yang P, Han Z, Liu K, Kuba K, Song B, Gao J, Mo Z, Li D, Li B, Li Q, Zhong N, Wang C, Penninger JM, Jiang C (2015). Cationic nanoparticles directly bind angiotensin-converting enzyme 2 and induce acute lung injury in mice. Part Fibre Toxicol. 7;12:4.
[8] Perlman S. et al (2007). Lethal infection of K18-hACE2 mice infected with severe acute respiratory syndrome coronavirus. J Virol. 81(2):813-21.
[9]NetlandJ.etal(2008).Severe acute respiratory syndrome coronavirus infection causes neuronal death in the absence of encephalitis in mice transgenic for human ACE2. J Virol. 82(15):7264-75.
[10] Menachery VD, et al. (2016). SARS-like WIV1-CoV poised for human emergence. Proc Natl Acad Sci USA. 113(11):3048-53.
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撰稿：李秉宣
編輯：錢利圣
審核：王宏宇
撰稿：李秉宣
編輯：錢利圣
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