PeproTech胃上皮類器官培養(yǎng)的原理與方法

近年來，類器官培養(yǎng)熱潮一直不斷攀升，而胃類器官也受到大多數(shù)人的關注，胃類器官是一種衍生于胃干細胞或者多能誘導干細胞的類器官模型，體外培養(yǎng)的胃類器官含有多種細胞克隆亞群，其培養(yǎng)環(huán)境模擬活體內(nèi)的真實微環(huán)境，因此胃類器官在細胞成分、組織構架及特定功能等方面與胃上皮組織高度相似，可實現(xiàn)在體外培養(yǎng)環(huán)境中對胃上皮組織的復制，為人類胃生理與疾病的研究提供了一個新的平臺。

胃類器官的培養(yǎng)較為繁瑣，特別是獲取原始干細胞操作步驟較多，操作時間長，培養(yǎng)過程中也有些注意事項，對于初學者若不注意一些操作細節(jié)，很可能導致培養(yǎng)失敗。所以PeproTech技術員實踐總結(jié)了以下全面的操作流程，并強調(diào)在培養(yǎng)操作中的注意要點，以便您可以清楚透徹的get其培養(yǎng)方法，幫助大家提高培養(yǎng)的成功率。

3) 重復該重懸清洗步驟 5 ～10 次至上清液清亮，棄上清。
4) 最后一次漂洗后，吸除大部分上清液，向沉淀中加入含10 mM EDTA溶液(25 ml)室溫消化60 min后，棄上清。
5) 加入10 ml冰PBS用移液管輕輕吹打幾次，等待組織塊沉淀下去，棄去上清，將組織塊轉(zhuǎn)移到10 cm²的培養(yǎng)皿中，在組織塊上覆蓋一個無菌的載玻片，戴上無菌手套，用兩手的大拇指按壓載玻片，將組織塊腺體中的細胞擠壓出來。

6) 加入PBS反復吹打培養(yǎng)皿和載玻片上的組織塊，吹打后等待組織塊自然沉降，小心吸取上清液并使用70 μm濾網(wǎng)過濾，將濾液收集于干凈的50 ml管中。
7) 如果收集的細胞不夠多，可以重復5)和6)步驟，將幾份混合液以200×g離心5 min。小心地倒出并丟棄上清液。
配置類器官培養(yǎng)基：
在基礎培養(yǎng)基中加入:

8) 將沉淀重懸于含有冰的類器官培養(yǎng)基中，吸取10 μL置于玻璃載玻片或血細胞計數(shù)器上。使用倒置顯微鏡，計數(shù)分離的細胞數(shù)目，200 g離心5 min，小心吸出并棄去上清。用類器官培養(yǎng)基重懸細胞至1.6 x10⁵個/ml
9) 將離心管置于冰上，吸取150 μL重懸好的細胞懸液，加入等體積的預冷的Matrigel，小心地上下吹打十次以充分混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡。
10) 吸取50 μL懸液，加入到提前預熱的24孔板每個孔中的中心部位，樣品應在每個孔的中心形成圓頂結(jié)構。為了防止接種時出現(xiàn)氣泡，槍頭內(nèi)液體不要全部打出。分別接種24孔板4個孔。
11) 將培養(yǎng)板在37°C下靜置10分鐘以待基質(zhì)膠完全凝固。將平板轉(zhuǎn)放入培養(yǎng)箱時，應注意不要破壞凝固后的液滴。
12) 使用移液槍沿著孔側(cè)壁向每個孔中輕輕地加入500 μL室溫(15-25℃)的配置的類器官培養(yǎng)基。不要將培養(yǎng)基從圓頂結(jié)構上直接加入。
13) 向其它未接種的孔中加入無菌PBS以保證培養(yǎng)時的濕度。 
14) 將培養(yǎng)板的蓋子蓋好，并在37℃和5％CO₂下進行培養(yǎng)。
15) 每隔2天進行完全換液。換液時將移液槍頭放在孔底邊緣小心地將原有液體培養(yǎng)基吸出，并加入為500 μL新鮮的室溫類器官培養(yǎng)基。
16) 在培養(yǎng)第7至10天以1:3~1:6的比例進行類器官傳代，以避免在類器官過度生長和空腔內(nèi)積累過量的碎屑。

1) 在成熟類器官的24孔板中，每孔加入約1000基礎培養(yǎng)基，使用無菌細胞刮刮取孔板中的基質(zhì)膠，收集每個孔中的懸液置于15 ml離心管中；
2) 將可以傳代的類器官冰上放置5～10 min；用1 ml大槍頭吹打?qū)⒒�質(zhì)膠打碎，吹打30下左右，此過程避免產(chǎn)生氣泡（調(diào)制量程到700 μL可避免氣泡產(chǎn)生）， 可取適量的懸液觀察，直至大部分類器官結(jié)構解離。其后步驟同胃類器官的制備方法中9)～13)
注：傳代中，若隱窩狀態(tài)良好可進行1:3傳代，若狀態(tài)較差可進行1:1傳代。全程可以維持約3個月的長期傳代擴增，且類器官狀態(tài)保持良好。

1) 胃解剖上可分為胃底、胃體、胃竇、幽門（小鼠胃還擁有前胃部分），對應的胃上皮可以分為胃底/體腺和胃竇/幽門腺兩部分，兩者在細胞構成上差別較大。它們均含有表面黏液細胞、頸粘液細胞、干細胞、內(nèi)分泌細胞；但胃底腺含有壁細胞（分泌鹽酸）和主細胞（分泌胃蛋白酶），而胃竇腺不含有這兩種細胞組分。胃底腺和胃竇腺均可以構建成胃上皮類器官。胃腺體內(nèi)的干細胞能夠分裂、分化，自發(fā)形成球囊狀結(jié)構；囊壁上含有所有腺體內(nèi)的細胞成分。囊內(nèi)為上皮的腔面，內(nèi)含脫落細胞、分泌物等；囊外為上皮的基底面，為細胞外基質(zhì)成分。
2) EDTA消化液需要用無鈣無鎂的PBS溶液進行稀釋，否則影響EDTA的螯合作用。