用細(xì)胞爬進(jìn)行RNA FISH檢測的實(shí)驗(yàn)操作

用細(xì)胞爬片進(jìn)行 RNA FISH 檢測的實(shí)驗(yàn)流程

1. 37℃，用合適的含有 FCS，抗生素和其他必要成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。
 

2. 收集有絲分裂細(xì)胞前 10~16 小時(shí)在培養(yǎng)基中以 0.06 μg/ml 的濃度加入秋水仙胺。
 

收獲細(xì)胞并在聚胺緩沖液中裂解

3. 收獲細(xì)胞。
 

對于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（500 ml 培養(yǎng)基），室溫 1500 g 離心 5 分鐘收獲細(xì)胞。在室溫用聚胺緩沖液清洗三次所得到的沉淀，1500 g 離心 5 分鐘收集細(xì)胞。

聚胺緩沖液：
 

15 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

0.2 mmol/L 精胺

0.5 mmol/L 精咪

2 mmol/L EDTA

80 mmoI/L KCl

0.1 mmol/L PMSF（臨用前從用 100% 乙醇制備的 1 mmol/L 的貯存液中加入）

4. 細(xì)胞用 20 ml 冰冷的含 0.1％ 毛地黃皂苷的聚胺緩沖液重懸浮。

5. 用 Dounce 勻漿器和 B 研棒進(jìn)行 10 次溫和勻漿裂解細(xì)胞（過于劇烈的勻漿會(huì)導(dǎo)致染色體明顯損傷）。另外也可以將懸液溫和地吸到一塑料注射器中，然后推動(dòng)便其通過 25 號(hào)針頭（應(yīng)避免溶液起泡沫）。

6. 細(xì)胞裂解后，取出少量裂解液觀察染色質(zhì)釋放情況。在有一滴用來進(jìn)行 DNA 染色的 2 μg/ml Hoechst 33258 的分離緩沖液溶液的載玻片上，滴一滴裂解懸液。用熒光顯微鏡觀察染色質(zhì)。

7. 用 JS-13 ( Beckman)，HB-4 (Sorvall)，2150 (Herace) 或相似的懸桶式轉(zhuǎn)頭在 250 g 離心 1 分鐘沉淀裂解液去除碎片。

8. 取出含有染色體的上清，3000 g 離心 15 分鐘。

9. 將含有染色體的沉淀重懸浮于 5~10 ml 的聚胺緩沖液中。制備的染色體可以在 4℃ 保存。保存 2~4 個(gè)星期后觀察不到形態(tài)的變化；但對于特殊目的的研究（例如酶活性，不穩(wěn)定蛋白），得到的染色體應(yīng)立即使用。