納米傅里葉紅外光譜與成像技術在實現(xiàn)單病毒膜滲透行為研究的應用

許多包膜病毒諸如人類免疫缺陷病毒（即艾滋病毒，HIV），埃博拉病毒、流行性感冒病毒（IFV）和冠狀肺炎病毒等致命性病毒對人類健康和公共衛(wèi)生構成了持續(xù)的威脅。因此，關于病毒開展的各方面研究備受關注。其中，包膜病毒的細胞膜滲透行為是病毒進入宿主細胞，感染宿主細胞等一系列事件中的關鍵步驟。在病毒進入宿主細胞的過程中，包膜病毒如何與宿主細胞受體相互作用以及病毒膜包膜自身如何經歷結構變化，最終進入宿主細胞的病毒-細胞膜滲透行為的研究，能為開發(fā)新型抗病毒療法和疫苗提供有利信息。

近年來，流感病毒（IFV， 結構示意圖1）已被用作包膜病毒的原型來研究病毒進入宿主細胞的過程。IFV中血凝素（HA）是嵌入IFV包膜的主要表面糖蛋白。 HA負責IFV與宿主細胞受體的連接，并在病毒進入過程中參與介導膜融合。眾多研究已經為靶標和病毒膜之間的融合機制建立了一個公認的模型。該模型認為只有在靶標和病毒膜發(fā)生膜融合時才可形成孔從而介導病毒-細胞膜滲透行為。然而，其他報道也觀察到在融合發(fā)生之前靶標和病毒膜的破裂。此外，關于腺病毒蛋白與宿主細胞的研究顯示，宿主細胞膜可能在沒有膜融合的情況下被破壞而進入病毒。另一方面，病毒包膜和靶宿主細胞膜具有不同的化學組成或結構，各個膜中形成孔的要求不同，因此靶宿主或病毒膜破裂也可能獨立地被誘導。

圖1 流感病毒示意圖 （圖片來自百度百科）
 

綜上所述，關于病毒-細胞膜滲透行為的機理還存在一定的爭議，明確單個病毒與宿主細胞的復雜融合機制，可為設計抗病毒化合物提供有利信息。然而，常規(guī)的病毒整體融合測定法是對膜融合事件的集體響應，不能對細微、尤其是在納米尺度復雜的融合細節(jié)進行直接和定量的研究，因此無法直接量化一些可以通過研究單個病毒、納米尺度表面糖蛋白和脂包膜來獲得的融合細節(jié)。例如，病毒感染過程在分子水平上引起的病毒膜和宿主細胞膜的化學和結構組成改變，可以通過分子特異性紅外光譜技術來探測。然而，單個病毒、表面糖蛋白和脂包膜尺寸小于紅外光的衍射極限，限制了單個病毒的紅外光譜研究。因此，找到一個既可以提供納米高空間分辨率，還能探測機械、化學特性（分子特異紅外光譜）和環(huán)境影響的工具，使其可在單病毒水平上研究病毒膜融合過程是十分重要的。

德國neaspec公司經多年研發(fā)的納米分辨傅里葉紅外光譜和成像系統(tǒng)（nano-FTIR & neaSNOM）采用化的散射式核心設計和準外差技術以及獨特的寬光譜高能激光器（光譜范圍：650—4000 cm^-1），基于傳統(tǒng)傅里葉紅外光譜的核心原理，使得光譜和成像信息直接源于光學信號，無需光-熱、光-力等復雜信號的轉換，能對空間分辨率低至10 nm的樣品進行直接的紅外光譜及成像測量，提供與傳統(tǒng)傅里葉光譜完全一致的紅外光譜測量結果。因此，德國neaspec公司的納米分辨傅里葉紅外光譜與成像系統(tǒng)可實現(xiàn)高分辨率單個病毒、表面糖蛋白和脂包膜的原位光譜、化學圖譜和結構鑒定，以及病毒與環(huán)境觸發(fā)因素和細胞的相互作用研究，是單病毒水平上研究病毒膜融合過程的工具。
 

圖2 德國neaspec公司納米分辨傅里葉紅外光譜與成像系統(tǒng)（ nano-FTIR & neaSNOM）實物圖

來自美國喬治亞大學和喬治亞州立大學的Sampath Gamage和Yohannes Abate等研究者采用 nano-FTIR & neaSNOM研究了單個原型包膜流感病毒X31在不同pH值環(huán)境中發(fā)生的結構變化。同時，還定量評估了在環(huán)境pH值變化期間,抗病毒化合物（化合物136）阻止病毒膜破壞的有效性，提供了一種抑制病毒進入細胞的新機制。

nano-FTIR和neaSNOM對流感病毒 X31的近場紅外光譜及成像研究提供了高空間分辨的優(yōu)異光譜和成像結果，具體結果如下：

1. 能清楚觀察到單個流感病毒的形貌（高度20-30 nm, 大小約70-100 nm）；

2. 不同紅外波長下病毒紅外吸收對比明顯；

3. HA富集在病毒包膜外（對比圖3 中f和g:包膜外1088 cm^-1無紅外吸收信號，1659 cm^-1 有紅外吸收信號，蛋白質在1659 cm^-1 有吸收而在1088 cm^-1沒有）；

4. nano-FTIR 能獲取到病毒蛋白紅外光譜（1500-1750 cm^-1范圍 Amide I 和Amide II 峰）；

5. nano-FTIR 能獲取到病毒的脂類、磷酸鹽和RNA的紅外光譜（1290-1050 cm^-1范圍）。

圖3 流感病毒的neaSNOM近場光學紅外成像 (pH 7.4) a)：實驗示意圖；b)：病毒形貌成像（標尺 100 nm）；c-e)：不同紅外波長下近場光學相位成像（紅外吸收）；f） 和 g)：b,c）和 b, e)紅色虛線相應的截面分析
 

圖4 流感病毒的nano-FTIR光譜及高光譜成像(pH 7.4)A)：nano-FTIR紅外吸收光譜（pH 7和pH 5）； B)：病毒形貌及高光譜成像（標尺 100 nm）
 

綜上所述，在該研究工作中，作者對單個流感病毒顆粒進行了光譜和成像實驗，研究了各種pH值變化環(huán)境中以及與抗病毒化合物相互作用時病毒蛋白和脂質雙層的化學和結構變化。結果表明在不存在靶細胞膜的情況下，降低pH環(huán)境依然會造成病毒包膜破裂，這與當前的病毒融合模型相反。此外，融合抑制劑化合物136可以有效阻止低pH環(huán)境引起的病毒包膜破壞。除流感病毒外，德國neaspec公司提供的nano-FTIR和neaSNOM技術同樣可能適用于其他包膜病毒（例如，HIV、冠狀肺炎病毒等）的研究，并能為基礎病毒學研究提供新思路。

參考文獻：

[1]Sampath Gamage, Yohannes Abate et al.， Probing structural changes in single enveloped virus particles using nano-infrared spectroscopic imaging， PLOS ONE.