Naica數(shù)字PCR技術(shù)解析在Favipiravir藥物抗B型流感病毒的應(yīng)用

病毒性肺炎（viral pneumonia）是由病毒侵犯肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞而造成的肺部炎癥，常由上呼吸道病毒感染向下蔓延引起。隨著呼吸道病毒檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，病毒性肺炎的發(fā)病率和死亡率逐漸得到認(rèn)識(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)流感病毒感染占病毒性肺炎患者的大多數(shù)。流感病毒是季節(jié)性流感和偶發(fā)性流感大流行的病原體。世衛(wèi)組織估計(jì)，流行病每年導(dǎo)致約300-500萬(wàn)嚴(yán)重病例，全球約有29萬(wàn)-65萬(wàn)人死于呼吸道疾病。目前流行的季節(jié)性流感病毒包括A型的H1N1和H3N2以及B型。已有報(bào)道指出，平均每個(gè)季節(jié)由B型流感病毒引起的病例占流感相關(guān)死亡的29%，而在B型流感高發(fā)期，這一比例高達(dá)95%。
 

目前，治療流感病毒感染的藥物主要有兩種，分別是M2離子通道阻滯劑(金剛烷胺、金剛乙胺)和神經(jīng)氨酸酶抑制劑NAIs(奧司他韋、扎那米韋、帕拉米韋和拉尼米韋)。由于廣泛耐藥的出現(xiàn)和對(duì)B型流感病毒缺乏療效，M2離子通道阻滯劑不再推薦使用；因此，NAIs成為抗病毒藥物的主要類別。然而，耐NAIs突變體的出現(xiàn)仍會(huì)降低其療效。因此，對(duì)耐NAIs突變體的研究變得至關(guān)重要。
 

近日，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國(guó)家流感中心（世界衛(wèi)生組織流感參比和研究合作中心）等聯(lián)合在《Virology》發(fā)表了名為Effectiveness of favipiravir (T-705) against wild-type and oseltamivir-resistant influenza B virus in mice的文章。Favipiravir法維吡韋也稱為T-705，靶向流感病毒的RNA依賴的RNA聚合酶RdRp，可抑制A，B和C型流感病毒，包括耐奧司他韋的菌株。該研究在其基礎(chǔ)上檢測(cè)了T-705對(duì)耐奧司他韋B型流感的功效。

在這項(xiàng)研究中，研究人員使用致死小鼠模型評(píng)估了T-705對(duì)野生型和耐奧司他韋的乙型流感病毒的影響。此外還評(píng)估了體內(nèi)藥物治療后是否發(fā)生了誘導(dǎo)對(duì)T-705敏感性降低的突變。結(jié)果顯示T-705以劑量依賴的方式保護(hù)小鼠免于致命感染。T-705還能顯著降低病毒載量和抑制肺病理學(xué)。此外，表型分析顯示T-705耐藥病毒在T-705處理后沒有出現(xiàn)，即T-705可以有效地保護(hù)小鼠免受野生型和對(duì)奧司他韋具有耐藥性的B型流感病毒的致命感染。
 

文中使用Naica Crystal Digital PCR系統(tǒng)評(píng)估了T-705對(duì)野生型和耐奧司他韋的小鼠呼吸道病毒載量的影響，具體為測(cè)定了小鼠肺部、鼻甲骨、氣管（對(duì)應(yīng)下面兩幅圖的C/E/F）中流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白1 (NS1)基因拷貝數(shù)。
 

法國(guó)Stilla Technologies Naica數(shù)字PCR平臺(tái)是實(shí)現(xiàn)DNA/RNA絕對(duì)定量的技術(shù)工具，自動(dòng)生成和組裝單層平鋪的微滴，進(jìn)行單分子PCR擴(kuò)增，通過(guò)高分辨率的三色熒光通道檢測(cè)，自動(dòng)QC質(zhì)控，識(shí)別三色熒光中有效的陰陽(yáng)性微滴，從而達(dá)到目的DNA/RNA的絕對(duì)定量檢測(cè)。同時(shí)提供原始數(shù)據(jù)、單微滴追溯等功能，確保數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。
 

◐ 只需一步加樣操作，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線是真正的絕對(duì)定量系統(tǒng)。通過(guò)對(duì)模板的有限稀釋，耐受抑制劑能力強(qiáng)，更有利于臨床、環(huán)境等復(fù)雜樣本的檢測(cè)。

◐ 有效微滴：25000~30000/樣本，實(shí)現(xiàn)低濃度、低豐度的核酸樣本進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

◐ 封閉式芯片設(shè)計(jì)，樣本間獨(dú)立，避免了加樣交叉污染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)防止擴(kuò)增后的氣溶膠污染，保證結(jié)果安全可靠和實(shí)驗(yàn)環(huán)境安全。