老年癡呆元兇-APOE三兄弟

癡呆和阿爾茨海默病

 

癡呆（Dementia）的種類很多，除了阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD，也叫老年癡呆）以外，還有血管性癡呆（Vascular dementia），額顳葉癡呆（Frontotemporal dementia）和路易小體癡呆（Dementia with Lewy bodies）等。其他疾病如亨廷頓綜合征（Huntington disease）或帕金森綜合癥（Parkinson disease）也伴有癡呆癥狀產(chǎn)生。不過，AD是所有癡呆中占比最大的，達到6到7成。接下來就是血管性癡呆和額顳頁癡呆，分別占比約為10-20%和10%，剩下的癡呆類型相對較少。不僅在癡呆中占有最大的比例，AD也是神經(jīng)退行性疾病中占比最多的，甚至超過了其余神經(jīng)退行性疾病病患數(shù)量的總和。

 

從癥狀上看，AD會影響病患的空間記憶，具體表現(xiàn)為在熟悉的地方會迷路；其次會頻繁忘記剛剛做過的事情，比如忘記自己吃過午飯；還有就是對于以往非常熟練的技能會變得很生疏；逐漸忘記朋友甚至親人的名字；時間概念混亂。到后期還會逐漸出現(xiàn)情緒暴躁、回避社交行為以及語言功能障礙等問題，最后生活不能自理直至各種器官衰竭而死去。

 

圖1. 阿爾茨海默癥癥狀及其在癡呆中的比例[1, 2]

 

阿爾茨海默癥負擔沉重但科研投入不足

 

這樣嚴重的疾病常常被我們當做是“老糊涂”了，在癥狀初期沒有給予足夠的重視，任其發(fā)展到晚期時已無可挽回。據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）2015年的統(tǒng)計，該年美國投入在癌癥研發(fā)上的經(jīng)費為50億美元，而投入在阿爾茨海默病上的只有5億美元；但是，美國全社會卻承擔著由阿爾茨海默癥帶來的2000億美元的沉重負擔，而所有癌癥造成的負擔加起來只有AD的一半；另一方面美國每年因阿爾茨海默病死亡的人數(shù)與罹患癌癥而死的人數(shù)幾乎相等。阿爾茨海默病之所以造成如此之重的經(jīng)濟負擔，除了對病患的治療費用以外，更大的花費在對于患者的看護上，而且AD發(fā)病后相對癌癥而言持續(xù)時間長，需要占用看護者的大量時間和精力，并剝奪了其創(chuàng)造社會價值的機會成本。

 

圖2. 2015年美國阿爾茨海默病與癌癥研發(fā)投入對比[3]

 

阿爾茨海默癥假說及藥物研發(fā)現(xiàn)狀

 

隨著多年來對AD研究的深入，我們已經(jīng)了解到AD有兩大病例特征，即患者腦中會存在大量由Aβ（Amyloid Beta）聚集而成的淀粉樣沉淀和由tau聚集而成的神經(jīng)纖維纏結，其中Aβ由APP（Amyloid Precursor Protein）經(jīng)過兩次剪切而成（BACE1剪第一刀，含有PS1/2的γ剪切酶負責補上一刀），tau蛋白則由MAPT（微管結合蛋白tau）基因編碼而來，并被過度磷酸化而聚集成纖維纏結。雖然現(xiàn)在我們投入巨大精力研究了APP，Aβ，BACE1（β-Secretase），PS1（γ-Secretase的組成部分）以及tau，并以這些蛋白作為靶點開發(fā)藥物，但這些藥物在最終臨床階段幾乎全部折戟沉沙。目前獲批的藥物僅僅是三種乙酰膽堿酶抑制劑和一種NMDA受體（一種介導神經(jīng)興奮性的受體）的抑制劑以及和腸道菌群相關的GV971，而且GV971目前機理不明確且沒有獲得廣泛使用，而前面幾種只能暫時緩解AD癥狀，并不能起到治療AD的作用，甚至連延緩病程也無法做到。

 

所以幾十年的研究中人們雖然對AD的認識在不斷深化，但在治療上并不像腫瘤和艾滋病以及傳染性疾病上那樣有實質性的突破。在臨床、動物、細胞等實驗中各種不一致的現(xiàn)象讓AD的機理更加撲朔迷離。另外值得注意的是，在臨床前的模式動物研究中，主要的基因編輯對象是Aβ源頭蛋白APP，以及γ剪切酶中的PS1以及β剪切酶（BACE1），其中前兩種基因的一些突變會造成AD發(fā)病程度的加重和發(fā)病時間的提前。我們把這兩種基因突變造成的AD稱為早發(fā)型AD。但這種遺傳性AD病例在所有的患者中只占不到5%的比例。真實情況是大部分病例是散發(fā)性的，即發(fā)病時間一般在65歲之后，并且也沒有APP和PS1的突變。而臨床實驗中面對的大部分病例屬于散發(fā)型，這或許是在模式動物中形勢喜人的藥物進入臨床后期后，效果令人失望的原因。

 

而另一個AD中形成神經(jīng)纖維纏結的tau蛋白編碼基因MAPT，其突變并不會直接造成Aβ的聚集，也不會產(chǎn)生淀粉樣沉淀。MAPT的突變是額顳葉癡呆的主要誘因之一，但AD卻幾乎與這種突變無關。AD病患腦中的tau聚集目前主流認為是Aβ或者炎癥引起的。針對該蛋白，雖然人們制作了很多基因編輯小鼠進行臨床前研究，也的確提升了我們對AD的了解，但針對tau作為靶點的藥物目前暫無令人振奮的結果。

 

圖3. 阿爾茨海默癥的Aβ假說[4]

 

APOE基因

 

有鑒于前文所述對AD不太成功的藥物研發(fā)經(jīng)歷，我們能否暫時跳出思維定式，將目光轉向其他的研究方向呢？

 

早在1993年，人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種叫做APOE的載脂蛋白，隨后的研究又發(fā)現(xiàn)這個蛋白與占AD病例95%的散發(fā)性AD有顯著的聯(lián)系。人類APOE基因位于第19號染色體上，編碼一個299個氨基酸的APOE蛋白。

 

該蛋白在人群中主要有三種，即APOE2，APOE3和APOE4。它們的區(qū)別在于APOE基因水平上兩個位點的改變，反應到蛋白層面就是這兩個位點（第112個氨基酸和第158個氨基酸）究竟是半胱氨酸（Cys）還是精氨酸（Arg）：

 

● 如果一條染色體上編碼得到的APOE兩個位點都是Cys，這條染色體就是APOE2型；

 

● 如果第112號位是Cys，而第158號位是Arg，那么這個載脂蛋白就是APOE3；

 

● 如果兩個都是Arg，那就是APOE4。

 

由于我們都有兩條染色體，一條來自老爸，一條來自老媽，在形成受精卵時你便有可能得到APOE的6種組合（E2/E2，E2/E3，E3/E3，E3/E4，E2/E4及E4/E4）。

 

注：這里有同學可能要問為什么沒有1型，答案是有的。其實還有5型，只不過這兩種在人群中出現(xiàn)的概率極低（加起來不到0.1%，而且其變化依據(jù)是其他位點的氨基酸）。此外還有一種被命名為APOE3r的蛋白，該蛋白與APOE3正好相反，112位為Arg，158位為Cys，這種出現(xiàn)的概率也很低，因此我們在接下來的內容中會重點講述在人群中分布最廣的2/3/4型APOE。

 

圖4. 人類APOE基因多態(tài)性[5]

 

人類APOE多態(tài)性影響AD發(fā)病率

 

在一項研究大樣本的研究中，通過檢測正常人群和輕度認知障礙人群中淀粉樣沉淀和APOE基因型之間的關系發(fā)現(xiàn)，無論是在哪種人群中，淀粉樣蛋白沉淀隨年齡增加的速度是APOE4 > APOE3 > APOE2。值得注意的是，APOE2的純合人群中，其淀粉樣蛋白的聚集幾乎沒有隨年齡增長而增加。

 

我們把分布最廣的APOE3純合人群的AD發(fā)病率作為基準，含有APOE4人群的AD發(fā)病率都是高于APOE3純合人群的，兩種雜合含APOE4的人群阿爾茨海默病的患病概率分別是APOE3純合的2.6和3.6倍；而純合的APOE4的AD發(fā)病率則猛增到15.5倍。但兩種APOE2基因型的人群中AD發(fā)病率幾乎只有APOE3的一半。這項研究說明，APOE4基因只要存在就會提高AD發(fā)病的概率，而APOE2能在一定程度上阻止AD的發(fā)生。

 

圖5. APOE多態(tài)性對AD發(fā)病率的影響[6]

 

APOE4對阿爾茨海默癥發(fā)病機理的影響

（Aβ假說層面）

 

根據(jù)尸體解剖研究發(fā)現(xiàn)，APOE4在AD病患的腦中與神經(jīng)元內的Aβ結合并聚集，從而形成淀粉樣蛋白沉淀，并且與Aβ寡聚體（有研究表明寡聚體的毒性高于淀粉樣沉淀）的數(shù)量正相關。首先我們要知道，三種APOE都能與Aβ直接結合，進而影響Aβ的清理和聚集。不過Aβ和APOE4的關系尤為親密，二者親和力最高。在各種APOE過表達的小鼠中，研究人員發(fā)現(xiàn)轉入APOE4基因的小鼠腦脊液中，Aβ含量是APOE2或者APOE3的2~4倍。另一項研究也發(fā)現(xiàn)星型細胞（Astrocyte）中APOE4的過量表達會引起細胞外Aβ的聚集，但這種現(xiàn)象在另兩種APOE小鼠中沒有發(fā)生。向人源化的幾種APOE小鼠腦中注射Aβ，會加劇hAPOE4小鼠的淀粉樣蛋白聚集，而hAPOE3小鼠則不受影響。

 

除了加劇Aβ的聚集外，APOE4也會抑制Aβ的清理，這一方面是由于APOE4與Aβ結合，導致部分蛋白降解通路成員無法順利結合Aβ，另一方面APOE4還會與Aβ競爭LRP1介導的細胞吸收作用，導致Aβ無法被及時清除，因此加劇了Aβ的聚集并損傷了相應APOE敲入小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)功能。Aβ的清理需要通過血腦屏障（blood–brain barrier，BBB）進入血管，讓Aβ被血液帶走。有研究表明APOE2/3-Aβ復合物是通過VLDLR和LRP1兩種受體穿過BBB的，而到了APOE4-Aβ復合物，就只能通過VLDLR了。要知道，VLDLR介導的APOE-Aβ內吞效率遠低于LRP1，因此，APOE4占主導的話，Aβ的清理就會被延誤。Neprilysin和IDE（insulin- degrading enzyme）是兩種負責Aβ清理酶的重要蛋白水解酶，攜帶APOE4基因的病患海馬中，這兩種酶的含量要大大低于非APOE4攜帶者。

 

圖6. APOE4對阿爾茨海默癥發(fā)病機理的影響[6]

 

APOE4對阿爾茨海默癥發(fā)病機理的影響

（非Aβ假說層面）

 

在Aβ之外，也有研究發(fā)現(xiàn)攜帶純合APOE4的人要比雜合子人群大腦中含有更多的tau聚集，在小鼠神經(jīng)元中特異性過表達APOE4會提高tau的磷酸化水平。通過將tau突變小鼠（P301S）與不同人源化APOE小鼠進行雜交，在得到的三種APOE-tau小鼠中，發(fā)現(xiàn)在動物飼養(yǎng)到9月齡時，APOE4-tau小鼠表現(xiàn)出明顯的大腦萎縮和神經(jīng)炎癥。

 

在突觸可塑性方面，APOE4也會減少樹突密度，并通過減少突觸谷氨酸受體影響突觸可塑性。尸檢中也發(fā)現(xiàn)一系列突觸標志物（如PSD95，Synaptophysin，Syntaxin1等）都在APOE4攜帶者中明顯下降。動物方面，人源化APOE4小鼠比起APOE3小鼠及未經(jīng)人源化的野生型小鼠而言，突觸標志物蛋白表達、樹突棘的密度和長度，突觸傳遞效率都下降顯著。

 

體外培養(yǎng)的人類神經(jīng)干細胞中，三種APOE的酯化能力（結合脂類物質的量）由大到小依次為APOE2，APOE3，APOE4。膽固醇從細胞內向腦脊液中運輸?shù)哪芰σ彩茿POE4最低。這種不同APOE載脂能力的差異在人源化APOE的小鼠中也得到了證實。

 

人們發(fā)現(xiàn)在AD發(fā)病前的很多年，這些人大腦中的糖代謝能力就已經(jīng)開始減弱。胰島素、胰島素受體、胰島素信號通路也在AD病患中受到損傷并影響到其認知能力。大量研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)APOE4攜帶者，會增加患糖尿病和胰島素抵抗等AD風險。上述這些臨床結果與人源化APOE4小鼠中進行的實驗結果一致，并且更進一步發(fā)現(xiàn)了這種對糖代謝的影響是通過下調PPARγ的表達及其信號通路實現(xiàn)的。在高脂食物飼養(yǎng)的情況下，APOE4小鼠比APOE3的糖分吸收能力低，同時也產(chǎn)生了胰島素抵抗以及認知功能的損傷。小鼠在年輕時（3月齡）吃高脂食物并不會因為APOE的不同而影響胰島素信號通路，但在22月齡時APOE基因型的不同就會造成糖代謝功能的明顯差異。

 

此外APOE也在炎癥反應、神經(jīng)損傷修復、α-Synuclein（PD致病蛋白）調節(jié)等多方面對AD產(chǎn)生影響。

 

一系列的研究表明，與分布最為廣泛的APOE3相比，APOE4等位基因會通過各種手段增加患上AD的風險，不論是在臨床相關性的觀察，還是在動物或者細胞實驗中的因果關系驗證上都為我們以APOE4作為靶點對抗AD打下了堅實的基礎。

 

圖7. APOE4影響AD發(fā)病的可能途徑[6]

 

未來APOE模式動物的應用

 

APOE調節(jié)膽固醇運輸和脂類代謝，Apoe敲除小鼠也是研究這類相關疾病的理想實驗動物，在Apoe敲除小鼠中會有自發(fā)的動脈粥樣硬化癥狀產(chǎn)生。如果我們把APOE3的功能作為基準，除了前文敘述過的不同APOE間的區(qū)別外：

 

● APOE2和APOE4與血漿甘油三酯的結合能力都要高于APOE3；

 

● 與血漿膽固醇的結合能力則是按APOE2，APOE3，APOE4的順序逐漸遞增；

 

● 蛋白穩(wěn)定性按APOE2，APOE3，APOE4的順序依次降低；

 

● APOE2與LDLR的親和力遠低于APOE3和APOE4；脂類結合能力上APOE4最強，同時其也是與VLDL親和力最高的APOE蛋白，另外兩種傾向于結合HDL。

 

在疾病方面，仍然將APOE3作為野生型看待，那么APOE2和APOE4都有3型高膽固醇血癥的可能；不同的是，APOE2更有可能誘發(fā)外周血管疾病和動脈粥樣硬化心血管疾病，而APOE4則更容易誘發(fā)心血管疾病和阿爾茨海默癥（圖8）。

 

當然，APOE的本職工作其實就是在中樞或者外周負責膽固醇以及其他脂類的調度運輸。目前總體而言，APOE在外周的功能其實研究得比中樞更加深入。不同的APOE雖然至多只有兩個氨基酸的差異，但是這種差異卻造成了結構上的改變，以至于不同APOE與其受體的結合能力產(chǎn)生了很大的差異，進而影響不同人群中和脂類相關的生理和病理過程。舉例說來，APOE2與LDLR受體的結合能力不到APOE3和APOE4與LDLR結合能力的1/50。因此，在外周，APOE2會造成富含甘油酸三酯的脂蛋白殘余聚集成顆粒，進而引起三型高脂蛋白血癥。另一個例子就是關于APOE4的了，APOE4更容易與VLDL形成顆粒，妨礙脂肪在外周組織中的分解，從而產(chǎn)生動脈粥樣硬化的潛在危險。

 

圖8. 三種APOE蛋白的主要差異總結[7]

 

小鼠本身只有一種APOE，而人類中的APOE則有三種主要形式。要透徹研究APOE的功能，就需要將人類的三種APOE在小鼠中表達。在以前的很多研究中，通常是構建APOE過表達的轉基因小鼠進行實驗。把這些小鼠和傳統(tǒng)的AD基因編輯小鼠雜交后的確也能產(chǎn)生反映APOE多態(tài)性與AD關聯(lián)的表型，但過表達并非理想的基因編輯方式，一方面是因為過表達量使蛋白豐度有違生理狀態(tài)，另一方面則是目的基因的隨機插入有可能破壞原有基因功能，對目的表型產(chǎn)生干擾。因此，在不改變小鼠原有APOE啟動子的情況下，將人的APOE蛋白（hAPOEs）替換原有的小鼠APOE進行的研究會更有意義，也更易將實驗結果向臨床轉化。而且從結果上來看，hAPOE4小鼠也產(chǎn)生了認知障礙和神經(jīng)突觸的損傷。并且在與引入了hAPP突變的小鼠雜交后，hAPOE4-hAPP小鼠也能產(chǎn)生淀粉樣沉淀，并且hAPOE4-hAPP小鼠產(chǎn)生的Aβ沉淀的量要高于hAPOE3-hAPP小鼠。

 

圖9. APOE敲除及人源化小鼠主要應用領域

 

關于APOE多態(tài)性與疾病的很多研究都是在臨床上先觀察現(xiàn)象，統(tǒng)計規(guī)律，提出假說，然后再利用人源化的APOE小鼠進行實驗，對因果關系進行驗證。利用APOE小鼠，我們可以對脂類代謝、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)中APOE作用的機理進行研究，也可以與很多疾病固有的模型小鼠進行雜交，尋找APOE與疾病固有的信號通路之間有著怎樣的相互作用關系。因此，在對疾病病理的探索和相應靶點的發(fā)現(xiàn)上，APOE基因編輯小鼠都將成為研究者們手中不可或缺的利器。

 

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參考文獻及引用圖片來源：

1. https://qbi.uq.edu.au/brain/dementia/types-dementia

2. https://www.urgentteam.com/news/determining-alzheimers-symptoms

3. https://www.ted.com/talks/samuel_cohen_alzheimer_s_is_not_normal_aging_and_we_can_cure_it

4. Patterson C , Feightner J W , Garcia A , et al. Diagnosis and treatment of dementia: 1. Risk assessment and primary prevention of Alzheimer disease[J]. Canadian Medical Association Journal, 2008, 178(5):548-556.

5. https://www.fatforweightloss.com.au/genetic-makeup

6. Yamazaki, Y., Zhao, N., Caulfield, T.R. et al. Apolipoprotein E and Alzheimer disease: pathobiology and targeting strategies. Nat Rev Neurol 15, 501–518 (2019).

7. Bos M M , Noordam R , Blauw G J , et al. The ApoE ε4 Isoform: Can the Risk of Diseases be Reduced by Environmental Factors?[J]. The Journals of Gerontology Series A Biological Sciences and Medical Sciences, 2018.