人肺臟類器官培養(yǎng)在探究新冠病毒感染肺的機(jī)制的應(yīng)用

 

 01/   hESCs的復(fù)蘇

預(yù)先將Matrigel(Cat#354277)從-80℃取出，置于冰上融化，隨后用預(yù)冷的DMEM/F1培養(yǎng)基稀釋100倍，取1ml加入六孔板的一個(gè)孔，晃勻至鋪滿孔板底部。六孔板置于37℃培養(yǎng)箱中至少30min，備用。mTesR1人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基提前從4℃冰箱取出，室溫放置約10min。從液氮凍存盒中取出H9細(xì)胞(hESC細(xì)胞系)，快速移入37℃水浴鍋中融化，輕柔晃動(dòng)至凍存管還剩小塊冰即取出，小心將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml離心管，加入５ml mTesR1培養(yǎng)基輕輕混勻細(xì)胞，1000rmp/5min離心，小心棄去上清，加入含10μM的Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞接種于基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日加入DMEM/F12培養(yǎng)基輕柔洗一次，更換新鮮不含Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

 02/   hESCs的培養(yǎng)

每天更換新鮮mTesR1培養(yǎng)基前應(yīng)觀察細(xì)胞狀態(tài)，若發(fā)現(xiàn)大量死細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基(剛復(fù)蘇的細(xì)胞狀態(tài)較差)，則棄去培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的DMEM/F12培養(yǎng)基輕柔洗細(xì)胞一次，棄去DMEM/F12培養(yǎng)基，加入新鮮mTesR1培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

 03/   hESCs的傳代

細(xì)胞約3~5天生長至80%匯合度，狀態(tài)良好的hESCs克隆明顯，邊緣光滑。細(xì)胞傳代時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要提前用Matrigel包被培養(yǎng)板，細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基洗2次，在六孔板每孔中加入1ml Accutase消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化3~5min，傳代比例為1:5~1:10。每隔2min在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，待克隆邊緣發(fā)亮即小心棄去消化液，加入2ml含10μM的Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基輕柔吹打細(xì)胞數(shù)次，收集細(xì)胞于15ml離心管，1000rmp/5min離心，小心棄去上清，加入含10μM的Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。過夜后更換新鮮的不含Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液。

 04/   hESCs的凍存

凍存液為含5~10％二甲基亞砜(DMSO)的血清替代品(KOSR)，置于４°Ｃ備用。按照前述細(xì)胞傳代的方法收集細(xì)胞，用細(xì)胞凍存液輕柔重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入凍存管，做好標(biāo)記，置于凍存盒，-80℃過夜后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。