微芯片熒光PCR在快速檢測畜禽動物源性成分的應(yīng)用

 我國是禽畜產(chǎn)品生產(chǎn)和消費(fèi)大國。食品及飼料中動物源性成分的檢測關(guān)系食品安全和畜牧業(yè)安全。近年來，市場上屢次出現(xiàn)不法分子在肉制品中摻雜摻假現(xiàn)象，食品安全問題層出不窮，尤其是牛羊肉中，經(jīng)常被曝光其中摻雜了一些豬肉、鴨肉甚至狐貍?cè)�、老鼠肉等，涉嫌虛假宣傳欺詐消費(fèi)者和侵犯消費(fèi)者的合法權(quán)益，降低食品安全的公眾信譽(yù)，造成不良社會影響。食品及飼料中動物源性成分檢測涉及到生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售以及加工等各環(huán)節(jié)，農(nóng)業(yè)部也相應(yīng)出臺各項法規(guī)，為更好保證食品安全和我國畜牧業(yè)安全生產(chǎn)，急需可靠的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和方法手段，而GB/T38164-2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法實(shí)時熒光PCR法》頒布實(shí)施，對畜禽動物源性成分檢測提供可靠監(jiān)督手段，有效提高檢驗(yàn)檢疫工作效率。
國家市場監(jiān)督管理總局、國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會聯(lián)合發(fā)布GB/T38164-2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法實(shí)時熒光PCR法》該標(biāo)準(zhǔn)由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、大連海關(guān)、青島海關(guān)、上海海關(guān)、沈陽海關(guān)起草。該標(biāo)準(zhǔn)于2019年10月18日正式實(shí)施。該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了了常見畜禽動物源性成分的實(shí)時熒光PCR檢測方法，適用于肉及加工品、內(nèi)臟、乳、動物飼料中黃牛、牦牛、水牛、綿羊、山羊、豬、駱駝、馬鹿、梅花鹿、馴鹿、兔、狗、雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴿子、火雞、貓、狐貍、水貂、貉、鼠物種成分的Taqman探針實(shí)時熒光PCR定性檢測。​

目前國內(nèi)外對于動物源性成分的檢測報道主要有顯微鏡檢法、紅外光譜法、ELISA、普通 PCR、基因芯片法，熒光定量 PCR 等方法，基于核酸檢測的方法是最普遍、最準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，其常用的技術(shù)方法包括普通定性 PCR、巢式 PCR、多重 PCR、熒光定量 PCR 等方法。普通定性 PCR 方法檢測效率低，尤其檢測多指標(biāo)樣本時更加費(fèi)時費(fèi)力。而熒光定量 PCR 方法靈敏度高，但其成本高，因此推出一種快速、方便、靈敏度高、成本低的檢測方法具有實(shí)際應(yīng)用意義。

前LUMEX專利凍干芯片結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)，與傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法相比，將試劑引物涂布在凍干芯片上，通過熒光定量PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了快速、方便、靈敏、成本低動物源成分快速檢測，操作便捷，大幅度縮短了檢測周期。在檢測項目方面，一張基因芯片即可同時對多種靶向基因并行檢測，一次實(shí)驗(yàn)即可得出全部結(jié)果，比傳統(tǒng)方法簡便、快捷、更節(jié)省人力，提高了檢測通量，實(shí)現(xiàn)多重檢測效果。同時極大減少了操作人員的工作量并避免了實(shí)驗(yàn)的人為誤差，方便、快捷、準(zhǔn)確。因凍干芯片熒光定量PCR法具有快速、簡便、成本低、靈敏度高、假陽性率低、高通量等特點(diǎn)，在實(shí)際工作中具有很大的意義，同時對開發(fā)快速高通量多指標(biāo)檢測的方法具有廣泛應(yīng)用。
LUMEX凍干芯片平臺結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)，針對中國市場中常見食品和飼料中主要動物源性成分，按照國內(nèi)檢測標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計凍干檢測芯片，可一次性對樣品中的多種動物源性成分進(jìn)行篩檢，包括：牛、豬、羊、駱駝、水牛、馬、驢等畜禽動物源性成分，并行反應(yīng)檢測目標(biāo)的數(shù)量得到很大提升，克服動物源性成分熒光定量PCR檢測方法的核心問題，極大地降低檢測成本和工作量，提高檢測效率和準(zhǔn)確性。此外實(shí)時熒光微芯片技術(shù)可根據(jù)客戶實(shí)際檢測需求定制動干芯片，實(shí)現(xiàn)一張基因芯片檢測多重靶向基因。
實(shí)時熒光微芯片技術(shù)優(yōu)勢如下：1）操作簡單，經(jīng)過一次樣本前處理，凍干芯片是平臺實(shí)現(xiàn) PCR 擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)單芯片同步檢測樣本中多種動物源性成分，具有平行分析和多重判斷的特點(diǎn)；2）檢驗(yàn)對象完備，包含了當(dāng)前市面上常見、常檢的動物源性成分檢測指標(biāo)，并且可以很方便的加入新的檢測指標(biāo)；3）專利親疏水芯片涂層結(jié)合凍干試劑，減少交叉污染，有效減少操作人員工作量，降低實(shí)驗(yàn)人為誤，，提高了系統(tǒng)的靈敏度和準(zhǔn)確性；4）凍干試劑平臺簡化操作步驟，操作簡單，無需冷鏈運(yùn)輸，適用于食品中動物源性成分的大規(guī)模檢測

檢測分析與擴(kuò)增結(jié)果判定。
對樣品進(jìn)行前處理，將處理后的樣品分成三等分，包括待測樣品，復(fù)檢樣品和留存樣品。 依據(jù)GB/T 35918的方法進(jìn)行提取，也可用等效DNA提取試劑盒提取DNA。按照GB/T34796方法測定并計算DNA濃度，判定DNA和純度。

檢測過程中設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。樣品和對照設(shè)置2個平行的反應(yīng)體系，分別進(jìn)行靶向基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增， 以Ct平均值作為最終結(jié)果。如果Ct值≤35.0，判定為被檢樣品為陽性。 如果Ct值≥40.0，判定被檢樣品陰性；如果35.0＜Ct值＜40.0，則重復(fù)一次。如再次擴(kuò)增后Ct值仍為＜40.0，判定被檢樣品陽性；如再次擴(kuò)增后，Ct值≥40.0，判定被檢樣品陰性。
 
生肉樣品（n=6）的微芯片實(shí)時PCR結(jié)果：牛（粉色曲線）、羊（青色曲線）、豬（綠色曲線），只有相應(yīng)的試劑盒對目標(biāo)樣品呈陽性，其他試劑盒呈陰性。陽性對照（藍(lán)色曲線）和內(nèi)部對照（IC）（黃色曲線）為陽性。

結(jié)果可見，動物源成分凍干芯片檢測結(jié)果確，顯示了良好的物種檢測特異性，檢出的成分與預(yù)先提供的檢測結(jié)果一致，凍干片熒光定量PCR技術(shù)具有良好的特異性、可重復(fù)性、靈敏度和穩(wěn)定性，能夠同時進(jìn)行多樣品、多項目檢測，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、低成本的特點(diǎn)，是目前傳統(tǒng)方法所不具備的。