多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)MIRPA的引物與探針設(shè)計(jì)指導(dǎo)

近期,頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊連發(fā)兩篇頂級(jí)論文，上半年引爆生物圈的華人科學(xué)家張鋒教授團(tuán)隊(duì)又有新動(dòng)作!這次,他在一月內(nèi),分別在《Nature》、《Science》連發(fā)兩篇論文!他將CRISPR-Cas13a改造成了靈敏度達(dá)到了阿摩爾級(jí)(aM,10的負(fù)18次方摩爾每升),可以檢測(cè)單分子的SHERLOCK技術(shù)。而這其中,RPA起到了不小的作用。

RPA,即重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù),是在由多種酶和蛋白的參與下,在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸指數(shù)擴(kuò)增的技術(shù),被稱為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)。是英國(guó)TwistDx公司開發(fā)的，該公司通過(guò)突破等溫DNA擴(kuò)增，開發(fā)的重組酶聚合酶擴(kuò)增專利技術(shù)（RPA），被譽(yù)為DNA診斷領(lǐng)域的革命性創(chuàng)新。

安普未來(lái)生物科技有限公司經(jīng)過(guò)十年技術(shù)沉淀，以代表未來(lái)技術(shù)趨勢(shì)的多酶恒溫快速擴(kuò)增技術(shù)，MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）。

MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）技術(shù)是一種多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)，

基本原理是：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體 Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白 SSB 的幫助下，侵入雙鏈 DNA 模板；在侵入位點(diǎn)形成 D-loop 區(qū)域，并開始對(duì) DNA 雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后，復(fù)合體 Rec/ssDNA 解體的同時(shí)，聚合酶也結(jié)合到引物的 3’末端，開始鏈的延伸，這個(gè)過(guò)程迅速高效地循環(huán)，從而完成目的片段超快速擴(kuò)增。

熒光檢測(cè)則依賴核酸外切酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計(jì)的特異的分子探針，使用熒光監(jiān)測(cè)設(shè)備實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)片段擴(kuò)增過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。
 
★引物設(shè)計(jì)

建議使用長(zhǎng)度在 30-35bp 的引物，引物過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度（特殊情況下設(shè)計(jì)較長(zhǎng)

引物比較困難的序列，引物長(zhǎng)度可縮短至 25 bp，但最好不少于 25 bp）；引物序列要求：
1.堿基排布隨機(jī)性高，GC 含量在 30%-70%之間；
2.擴(kuò)增片段避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；
3.擴(kuò)增片段長(zhǎng)度建議在 150-300 bp，通常不超過(guò) 500 bp。

★熒光探針設(shè)計(jì)

在上下游引物中間，設(shè)計(jì)一段長(zhǎng)度為 46-52nt 與目的片段互補(bǔ)的序列作為熒光探針；探針序列不與特異
性引物識(shí)別位點(diǎn)重疊，長(zhǎng)度為 46-52 nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有四

個(gè)修飾位點(diǎn)：
1.距離 5’端的 30-35 nt 的中部位置標(biāo)記一個(gè) dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識(shí)別位點(diǎn) （任
何堿基，無(wú)特殊要求） ；
2.THF 位點(diǎn)的上游的 T 堿基上標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)（如 FAM），下游在 T 堿基上標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（如
BHQ1），兩個(gè)基團(tuán)的間距為 2-4 nt；
3.THF 距離 3’末端約 15 nt，并且 3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或 C3-spacer。
4.探針示例：
探針序列：
5’-ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAGCTCTCAAAGATGGACC-3’
                30-35nt                                ≥15nt

探針修飾：
ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAG[FAM-dT]AG[THF][BHQ-dT]CTCAAAGATGGACC-3’C3spacer。
 http://www.warbio.cn/news/show-1388.htm