晚期結(jié)直腸癌中NKG2D-CAR基因修飾的NK細胞過繼輸注的研究

    　結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率和死亡率分別位居第二位和第三位。結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，約20%的結(jié)直腸癌患者在診斷時就已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。對于轉(zhuǎn)移病灶不可切患者的治療主要以姑息性化療和靶向治療為主，其治療效果差強人意。
 

　　2018 年諾貝爾醫(yī)學及生理學獎獲獎?wù)呙绹�德克薩斯大學的免疫學家詹姆斯·艾利森（James Allison）和日本日本京都大學的免疫學家本庶佑，他們的研究提供了一種通過刺激免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤細胞的癌癥治療方法，并且基于這些研究也開發(fā)出了相應(yīng)的藥物，人類在治療腫瘤上已經(jīng)取得了非常重要的突破。然而，由于腫瘤致病機理復(fù)雜、患者個體的差異性也很大，再加上環(huán)境因素的影響，最終的治療效果仍然達不到人們的滿意。廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院徐學虎教授團隊設(shè)想通過探索過繼免疫細胞輸注治療的方向，以期能改善目前對晚期結(jié)直腸癌的治療現(xiàn)狀。

　　過繼免疫細胞輸注治療是一種不同于免疫檢查點抑制劑的新型的抗腫瘤免疫治療模式。其中嵌合抗原受體T細胞免疫治療（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T）被認為是當前最具前景的抗腫瘤治療方式之一。而嵌合抗原受體NK細胞免疫治療（CAR-NK）異曲同工之妙，將修飾的免疫細胞由T細胞變?yōu)镹K細胞，而且有越來越多的臨床前研究表明CAR-NK細胞同樣具有顯著的抗瘤能力。
 

　　徐學虎教授團隊近日在醫(yī)學1區(qū)雜志《Molecular Therapy》（IF：7.008）上報道了“NKG2D-CAR基因修飾的NK治療結(jié)直腸癌患者的臨床研究”的試驗結(jié)果。這是一項單臂、開放，劑量遞增的單中心的初期臨床研究，共入組了3例經(jīng)標準治療失敗的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者。

　　在臨床前研究階段，鑒于包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞均高表達NKG2D配體的特征，而在正常組織中其表達含量很低或無，所以團隊成員選擇腫瘤相關(guān)抗原--NKG2D配體作為治療靶點，并通過電穿孔的手段將NKG2D-mRNA轉(zhuǎn)導NK細胞，成功構(gòu)建了靶向NKG2D配體的CAR-NK細胞。

　　首先，徐學虎教授團隊利用了NEPA21（電轉(zhuǎn)染儀）  mRNA電穿孔方法（來自 NEPAGENE公司的 NEPA21 高效基因電轉(zhuǎn)染系統(tǒng) ），從體內(nèi)外實驗中均展示了NKG2D CAR-NK細胞對高表達NKG2D配體的腫瘤細胞顯著的特異性殺傷能力。為了比較NKG2Dz和NKG2Dp mRNA-CARs電穿孔NK細胞誘導的細胞毒性免疫反應(yīng)，在相同的供體和相同的對照條件下，用相同量的mRNA-CARs電穿孔NK細胞，利用EGFP mRNA在NK細胞中優(yōu)化RNA電穿孔，其轉(zhuǎn)染效率接近99%（圖S2）。實驗結(jié)果表明，NKG2Dp-CAR修飾的NK細胞更有效地殺傷癌細胞�；�于這些結(jié)果，NKG2Dp-CAR修飾的NK細胞作為動物和臨床試驗的研究目標。

　　為了驗證NKG2D RNACAR修飾的NK細胞在體內(nèi)的抑瘤作用，建立異種植入人結(jié)直腸癌細胞株的NSG小鼠模型，利用活體生物成像技術(shù)(BLI)比較分別給予phosphate-buffered saline (PBS), NK細胞和NKG2DCAR-NK細胞處理的小鼠體內(nèi)腫瘤負荷光信號，結(jié)果顯示PBS組小鼠平均生存時間為36天，低于NK細胞組小鼠平均45天的水平，說明NK細胞對延緩腫瘤生長提高小鼠生存時間具有一定療效，而NKG2D CAR-NK細胞組全部5只小鼠的腫瘤生長被抑制，并且平均生存時間提高到69天，由此可見，CAR-NK細胞能夠有效的殺傷小鼠體內(nèi)腫瘤。

　　隨后，對3例化療難治性轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進行了一項初步臨床試驗研究，以評價NKG2Dp-CAR基因表達修飾的NK細胞過繼細胞治療的安全性和可行性。先為三例病人制備CAR-NK細胞，并展示了用于患者治療的CAR-NK細胞的產(chǎn)生和特性，包括CAR-NK細胞釋放標準和電穿孔后CAR-NK細胞的活性（圖S4）。

　　隨后，在臨床試驗中驗證NKG2D-CAR基因修飾的NK細胞過繼治療的安全性和可行性。研究一共入組了3例經(jīng)標準治療失敗的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，前兩例為有腹腔轉(zhuǎn)移伴惡性腹水患者，以劑量遞增的形式通過腹腔輸注的方式分別給予2次（2×107-1×108個CAR-NK細胞）和4次（1×108-7×108個CAR-NK細胞）細胞輸注，每周一次。治療過程中和結(jié)束后，可觀察到24小時腹水生成量以及腹水中腫瘤細胞數(shù)的顯著減少；同時，第二位患者CT平掃亦顯示治療后腹腔內(nèi)腹水含量較基線減少；腹水性狀從渾濁狀變?yōu)榈�黃色澄清狀。

　　第三例為腹腔轉(zhuǎn)移伴不可切除的肝轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，一共給予6次（5×108-2×109個CAR-NK細胞）細胞輸注，每周兩次。從第二次輸注開始，一半細胞通過超聲引導下局部輸注至PET-CT顯示為高代謝活性的肝右后葉下段（S6），剩余細胞則通過腹腔內(nèi)輸注。治療結(jié)束后，通過治療前后PET-CT對比，可觀察到局部輸注腫瘤灶（S6）的代謝恢復(fù)至背景值，且通過組織切片染色證明局部輸注腫瘤組織的大量壞死。

　　本研究報道的NKG2D-CAR基因修飾的NK細胞過繼輸注為提高腫瘤免疫治療效果提供了一種新的選擇，尤其是在發(fā)展通用安全的“貨架型”CAR療法用于異基因細胞治療方面尤其具有吸引力。

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