新冠病毒核酸檢測(cè)PCR技術(shù)知識(shí)點(diǎn)梳理

近日，由于全國(guó)復(fù)工復(fù)產(chǎn)復(fù)學(xué)的大量需求，阿里健康、美團(tuán)App 等線上平臺(tái)聯(lián)合各大第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)，陸續(xù)開(kāi)放了線上預(yù)約新冠病毒核酸檢測(cè)服務(wù)。

 

開(kāi)通服務(wù)的地區(qū)，人們可以拿起手機(jī)即可便捷的預(yù)約核酸檢測(cè)，最快24小時(shí)即可拿到結(jié)果。如此便捷的服務(wù)，讓廣大民眾歡欣鼓舞，科技的發(fā)展又一次為人們的生活帶來(lái)翻天覆地的變化。

 

談技術(shù)之前，咱們先說(shuō)點(diǎn)國(guó)計(jì)民生重要的事情：

 

根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局官網(wǎng)數(shù)據(jù)查詢信息，國(guó)內(nèi)已有19個(gè)新冠病毒核酸檢測(cè)產(chǎn)品取得醫(yī)療器械注冊(cè)證書(shū)，如下圖。

 

廣大醫(yī)療機(jī)構(gòu)及百姓做核酸檢測(cè)的時(shí)候，請(qǐng)一定要認(rèn)準(zhǔn)這些合法的產(chǎn)品和企業(yè)！

 

 

而瀏覽完上表，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)，大部分的新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒的原理都是基于熒光PCR法，對(duì)于一直活躍在科研圈的工作者，自然對(duì)鼎鼎大名的PCR技術(shù)不陌生，那么熒光PCR、qPCR、RT-PCR等等各種PCR技術(shù)，您分得清嗎？是不是還在犯迷糊呢？

 

 

今天，小艾就帶你區(qū)分區(qū)分，梳理一下分子診斷領(lǐng)域的“杠把子”-PCR技術(shù)：

 

PCR，也就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction），是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅擴(kuò)增，放大，用于后續(xù)的檢測(cè)和基因比對(duì)。因此，無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對(duì)。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。

 

 

PCR由1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。所有的各種PCR都是在此基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)的，比如熒光PCR、qPCR、RT-QPCR等。

 

什么是熒光PCR？

 

熒光PCR技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的一種新型核酸定量技術(shù)。該技術(shù)具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、快速、靈敏、精確等特點(diǎn)，是對(duì)原有PCR技術(shù)的革新，擴(kuò)大了PCR的應(yīng)用范圍。

 

熒光PCR法根據(jù)化學(xué)發(fā)光原理可以分為染料法和探針?lè)�，它們的區(qū)別是什么呢？

 

1.染料法：可用的染料有SYBR®Green I 、SolisGreen® 等；染料能夠與DNA雙鏈結(jié)合，當(dāng)PCR擴(kuò)增的時(shí)候，染料結(jié)合到DNA上，從而發(fā)光，單個(gè)的染料不發(fā)光，這樣就能收集到信號(hào)。

 

 

2.探針?lè)ǎ篢aqMan 探針?lè)�即除了引物外另外設(shè)置一個(gè)探針，在探針的兩端分別帶上發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，這個(gè)時(shí)候，兩個(gè)平衡不發(fā)光，但是當(dāng)DNA通過(guò)引物合成的時(shí)候，探針被折斷，釋放出發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，兩個(gè)距離較遠(yuǎn)，發(fā)光基團(tuán)產(chǎn)生熒光，被機(jī)器收集到信號(hào)，從而檢測(cè)到基因的量。

 

 

根據(jù)擴(kuò)增策略和檢測(cè)產(chǎn)物手段的不同，PCR又可分為定性PCR和定量PCR。這里主要說(shuō)一說(shuō)定量PCR。

 

定量PCR，也就是qPCR,由于其英文全稱是real-time quantitative polymerase chain reaction，有些也稱為RT-qPCR，國(guó)外通常簡(jiǎn)稱為qPCR,是由美國(guó)Applied Bisystems公司于1996年研制出的一種新型核酸定量技術(shù)，并隨著熒光PCR 儀的推出而逐漸得到廣泛應(yīng)用。也是現(xiàn)在常用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)，該技術(shù)在常規(guī)PCR 基礎(chǔ)上運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象( fluorescence resonance energy transfer, FRET) 技術(shù), 加入熒光標(biāo)記探針, 巧妙地把核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合在一起, 在PCR 指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量, 并據(jù)此推斷目的基因的初始量。

 

RT-PCR,實(shí)際上是反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction），又稱逆轉(zhuǎn)錄PCR。國(guó)際上的約定俗成的是：RT-PCR 特指反轉(zhuǎn)錄 PCR，而 Real-time PCR 一般縮寫(xiě)為 qPCR（quantitative real-time PCR）

 

RT-PCR原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄稱cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因的表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。

 

RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用檢測(cè)細(xì)胞、組織中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特點(diǎn)基因的cDNA序列等。如果用于定量檢測(cè)，就是上文提到的qPCR， 此次新冠病毒核酸檢測(cè)熒光PCR技術(shù)，就是基于此。

 

 

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新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒優(yōu)勢(shì)：

 

    特異識(shí)別和檢測(cè)新冠病毒SARS-CoV-2

    適用于人痰液、鼻液、咽拭子樣本

    可信度高、即用型、快速出結(jié)果 < 2 hr

 

新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理圖示：

 

 

新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒組分：

 

新冠病毒全套核酸PCR檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)#K1460-100）
中文名	英文名
2X qPCR主要預(yù)混物	2X qPCR Master Mix
反轉(zhuǎn)錄預(yù)混物	Reverse Transcription Mix
PCR引物和探針套裝	PCR Primer/ Probe set
緩沖液	Rehydration Buffer
新冠病毒陽(yáng)性對(duì)照	COVID-19 Positive control (PTC)
陰性對(duì)照	Non-Template Negative Control (NTC)

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新冠病毒一步法PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理：是基于一步法反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（real-time RT-PCR）,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒RNA實(shí)現(xiàn)快速高效的檢測(cè)新冠病毒(SARS-CoV-2)

 

新冠病毒一步法PCR檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)#08-65-00250）組分：

 

 

小編福利：如果想要獲取新型冠狀病毒核酸檢測(cè)引物和探針序列（Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus）可以參考

 

    中國(guó)國(guó)家疾病控制中心

 

鏈接：http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html

 

    WHO幫助文件《Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR》

 

（原文鏈接地址：https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2），其中RdRP_SARSr-P2為檢測(cè)2019-conV的特異性探針，P1為通用探針，能檢測(cè)2019-nCoV、SARS-CoV以及bat-SARS-related CoV。

艾美捷科技有限公司，通過(guò)提供完整的產(chǎn)品和服務(wù)體系、便利的客戶關(guān)系和供應(yīng)鏈管理，為生命科學(xué)研究工作者提供整體打包方案。我們的企業(yè)的核心價(jià)值觀：“學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓越”。激發(fā)我們內(nèi)在的創(chuàng)造力，提供有競(jìng)爭(zhēng)力的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品和服務(wù)，持續(xù)為客戶創(chuàng)造最大價(jià)值是我們的企業(yè)使命。我們的企業(yè)愿景是成為受人尊重、世界一流的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品及服務(wù)供應(yīng)商。

 

作為一家具有尖端的技術(shù)實(shí)力、一流的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷售體系的生物高科技企業(yè)，總部位于武漢光谷國(guó)家級(jí)高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)，服務(wù)面向全國(guó)。艾美捷科技是集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，為用戶提供最前沿的專業(yè)資訊、完備的產(chǎn)品、整合的解決方案，及優(yōu)質(zhì)的物流服務(wù)。為了更好的服務(wù)客戶，公司組建了一支經(jīng)驗(yàn)豐富的研發(fā)團(tuán)隊(duì)-艾美捷生物技術(shù)中心，進(jìn)入研發(fā)生產(chǎn)階段，將更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品推薦給國(guó)內(nèi)生物領(lǐng)域的同仁們!