FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)應用案例——植物病害表型研究

1. 植物病害早期快速無損檢測

由于次生代謝產(chǎn)物如多酚等與植物的病害脅迫應答機制緊密相關(guān)。因此最初，F(xiàn)luorCam多光譜熒光成像技術(shù)主要用于植物病害早期快速無損檢測，希望能在病害產(chǎn)生嚴重影響前就能發(fā)現(xiàn)感染（圖4）。                 圖1. UV-MCF多光譜熒光成像早期研究，左：煙草花葉病毒感染的多光譜熒光連續(xù)觀測（Chaerle，2006）；右：辣椒輕斑駁病毒感染早期的多光譜熒光分析（Pineda，2008）

隨著研究的不斷深入，科學家們將多光譜熒光成像與葉綠素熒光成像、紅外熱成像、以NDVI歸一化植被指數(shù)為代表的反射光譜成像等其他表型分析技術(shù)結(jié)合，開展了更深入的植物病害檢測和表型研究工作。

德國萊布尼茨蔬菜和觀賞植物研究所IGZ致力于通過這些成像分析技術(shù)發(fā)展一種能夠高通量快速檢測生物脅迫的方法。他們使用了一種模式植物-病原體系統(tǒng)生菜-立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），希望通過這幾種技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)能夠快速將受到生物脅迫和未受到脅迫的植株區(qū)分開（Sandmann，2017）。

圖2. 生菜-立枯絲核菌的NDVI成像圖與熱成像圖

由于這幾種技術(shù)的原理不盡相同，類似的研究中經(jīng)常需要使用多種儀器才能完成。而FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)是目前唯一有能力實現(xiàn)了一臺儀器上同時完成葉綠素熒光、多光譜熒光、NDVI歸一化植被指數(shù)以及GFP、YFP、BFP、RFP、CFP、DAPI等熒光蛋白與熒光染料的成像分析功能，加裝熱成像模塊后還可以進行熱成像分析。這些功能使得FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)就成為了一套功能非常全面的植物病害表型研究系統(tǒng)。

通過數(shù)據(jù)分析最終發(fā)現(xiàn)葉綠素熒光參數(shù)：PSII最大量子產(chǎn)額Fv/Fm和熒光衰減比率Rfd的區(qū)分效果最好，誤差≤0.052。研究者希望通過進一步工作，將這一發(fā)現(xiàn)應用于園藝和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐。

圖3. FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)測量的各項表型參數(shù)及分析數(shù)據(jù)結(jié)果

2. 葉片病害

細菌性軟腐病菌Dickeya dadantii是農(nóng)業(yè)上的重要病害。這種病菌會先圍繞一個萎黃環(huán)出現(xiàn)多個壞死斑點，進而整個感染區(qū)域壞死并逐漸擴展到周圍的組織中。FluorCam葉綠素熒光成像、FluorCam多光譜熒光成像、熱成像可以在時間和空間尺度上分別反映細菌感染對光合作用、初級和次級代謝和氣孔活性的影響。西班牙國家研究委員會（CSIC）使用這三種技術(shù)對甜瓜葉感染Dickeya dadantii進行了成像測量，同時通過機器學習來處理這些成像技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)，建立數(shù)學算法來分類葉片感染區(qū)域（Pineda, 2018）。

圖4. 甜瓜葉感染Dickeya dadantii不同時期的葉綠素熒光成像、多光譜熒光成像和熱成像圖

根據(jù)成像圖獲得的葉綠素熒光和多光譜熒光定量數(shù)據(jù)

除病毒和細菌外，真菌引起的植物葉片病害也有廣泛的研究，比如由真菌Podosphaera fusc感染引起的白粉病。通過對感染白粉病的西葫蘆葉片進行FluorCam多光譜熒光和熱成像分析，發(fā)現(xiàn)多光譜熒光參數(shù)F520/F680對于識別白粉病特別靈敏。這也證明了多光譜熒光非常適用于類似的植物表型研究（Pineda, 2017）。

圖5. 感染白粉病的西葫蘆葉片：（a）RGB成像；（b）熱成像；（c）多光譜熒光F440成像；（d）多光譜熒光F520/F680成像

3. 根系病害

由于根系難以直接觀察和檢測，因此根系病害具有一定的隱蔽性。往往在發(fā)現(xiàn)病害時，其癥狀已經(jīng)發(fā)展到中后期。鱷梨根系感染白紋羽病Rosellinia necatrix后，通過葉片的葉綠素熒光成像、多光譜熒光成像、熱成像分析，發(fā)現(xiàn)病害造成的根系功能損失，能夠同步影響葉片的光合生理、次生代謝和氣孔功能。而葉綠素熒光參數(shù)甚至可以在癥狀發(fā)展前就指示出病害的發(fā)生。通過FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)進行的這一研究既發(fā)現(xiàn)了根系病害對植物整體生理功能和地上部表型的影響，也為根系病害提供了早期檢測工具（Granum, 2015）。

圖6. 感染白紋羽病的鱷梨：左：地上部RGB圖；右：葉綠素熒光、多光譜熒光與熱成像圖

4. 種子病害

間座殼屬Diaporthe/擬莖點霉屬Phomopsis病原菌復合體是一類大豆種傳性病原體。它會首先感染大豆種子并以休眠菌絲的形態(tài)存活。而隨著大豆的萌發(fā)和生長，它就會造成大豆種腐病等嚴重病害。

阿根廷布宜諾斯艾利斯大學嘗試使用不同的非熱等離子體Non-thermal plasma處理間座殼屬Diaporthe/擬莖點霉屬Phomopsis病原菌復合體侵染的大豆種子，然后對種子萌發(fā)和營養(yǎng)生長狀況進行評估，從而確定這種種子病害消毒方法是否理想——既能控制病害，又不會對大豆的營養(yǎng)生長造成不利影響。FluorCam葉綠素熒光、FluorCam多光譜熒光成像、熱成像等都為這一研究提供的重要的數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非熱等離子體處理后的感染大豆，其光合能力與健康植株基本相同。而比起未進行處理的大豆，其生長狀況甚至有所提高（Pérez-Pizá, 2019）。

圖7. 左：不同感染狀況和處理后的大豆幼苗；右：大豆的RGB成像、熱成像、多光譜熒光成像

參考文獻：

1. Chaerle L, et al. 2006, Multi-color fluorescence imaging for early detection of the hypersensitive reaction to tobacco mosaic virus, Journal of Plant Physiology, doi:10.1016/j.jplph.2006.01.011

2. Pineda M, et al. 2008, Multicolor Fluorescence Imaging of Leaves—A Useful Tool for Visualizing Systemic Viral Infections in Plants, Photochemistry and Photobiology, 84: 1048-1060

3. Sandmann M, et al. 2017. The use of features from fluorescence, thermography and NDVI imaging to detect biotic stress in lettuce. Plant Disease, doi: 10.1094/PDIS-10-17-1536-RE

4. Pineda M, et al. 2018. Detection of bacterial infection in melon plants by classification methods based on imaging data. Front. Plant Sci. 9(164), doi: 10.3389/fpls.2018.00164

5. Pérez-Pizá MC, et al. 2019. Improvement of growth and yield of soybean plants through the application of non-thermal plasmas to seeds with different health status. Heliyon 5: e01495

6. Granum E, et al. 2015. Metabolic responses of avocado plants to stress induced by Rosellinia necatrix analysed by fluorescence and thermal imaging. Eur J Plant Pathol, DOI 10.1007/s10658-015-0640-9

7. Pineda M, et al. 2017. Use of multicolour fluorescence imaging for diagnosis of bacterial and fungal infection on zucchini by implementing machine learning. Functional Plant Biology, https://doi.org/10.1071/FP16164

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