熒光免疫斑點(diǎn)FluoroSpot技術(shù)在新冠免疫學(xué)研究的應(yīng)用

      【前情回顧】
       想同時進(jìn)行多細(xì)胞因子檢測，你只需要一個“復(fù)聯(lián)”FluoroSpot

       眾所周知，免疫反應(yīng)是由先天性免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制協(xié)調(diào)進(jìn)行的。適應(yīng)性免疫也就是后天免疫，其主要包括T淋巴細(xì)胞參與的體液免疫和B淋巴細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫。

       而當(dāng)機(jī)體要產(chǎn)生對抗病毒等病原體的永久免疫時，我們主要依靠的是細(xì)胞免疫，也就是可以分泌抗體的記憶B淋巴細(xì)胞，因?yàn)槠淇梢詫Σ《镜炔≡�體保持長久的記憶，當(dāng)病毒再次入侵機(jī)體時，記憶B細(xì)胞可以分泌大量抗體去對抗病毒，從而保護(hù)機(jī)體免受病毒的入侵。大多數(shù)情況下，B細(xì)胞效應(yīng)本身并不能獨(dú)自完成這個過程。細(xì)胞免疫與體液免疫是相互配合，保持一致的。

       目前，機(jī)體內(nèi)的抗體滴度是否是一種對抗新冠病毒SARS-CoV-2入侵機(jī)體的免疫保護(hù)的標(biāo)志物還存在很大爭議（了解更多信息請參見WHO網(wǎng)站）。因?yàn)�，雖然由T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)在發(fā)揮機(jī)體保護(hù)性的作用方面起著非常重要的作用，但是我們也不要忘記T細(xì)胞還具有免疫監(jiān)視的作用。

       對此，Mabtech公司做了一個初步研究。在研究中，可以原位分析細(xì)胞的熒光免疫斑點(diǎn)法FluoroSpot技術(shù)發(fā)揮了重要作用。FluoroSpot可以高度靈敏地分析細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子--比流式等這些實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度還要高出數(shù)百倍。FluoroSpot技術(shù)可以直接用病毒多肽重復(fù)刺激細(xì)胞。Mabtech此次研發(fā)小組選擇了同時分析細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌，因?yàn)榕c單獨(dú)分析IFN-γ相比，同時分析IL-2，更可以全面評估T細(xì)胞對病毒感染反應(yīng)（Chauvat et al，Hum Vaccin Immunother，2014）。同時，研發(fā)小組使用內(nèi)部開發(fā)的SARS-CoV-2 ELISA試劑盒分析研究了每個病人的抗體（IgG）水平，并將其與FluoroSpot數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。
       SARS-CoV-2特異性T細(xì)胞的數(shù)量與抗體滴度成反比

       7個從輕癥到中度癥狀的新冠病毒肺炎康復(fù)者的血樣（經(jīng)過PCR確診）。 提取的PBMC已經(jīng)新冠病毒（SARS-COV-2）肽庫刺激，并以T細(xì)胞特異性肽庫作為陽性對照。 SARS-COV-2肽庫包括：15聚體與11個重疊的棘突蛋白和核衣殼蛋白的S1和S2結(jié)構(gòu)域； JPT肽重疊。T細(xì)胞特異性肽庫包括：CMV肽庫, CEF延伸肽庫, CEFTA肽庫。T細(xì)胞反應(yīng)是使用IFN-γ/IL-2 FluoroSpot分析（250,000個細(xì)胞/孔）在Mabtech IRIS上進(jìn)行了分析。 此外，使用內(nèi)部開發(fā)的ELISA分析了SARS-CoV-2 棘突蛋白 RBD特異的IgG。

       根據(jù)上圖，我們得出這樣的結(jié)果：經(jīng)SARS-CoV-2多肽庫刺激后，所有COVID-19恢復(fù)期患者的Th1反應(yīng)均為陽性。 其中有6個人的SARS-CoV-2特異性IgG水平升高，但其中一名（C7）的IgG水平低于ELISA檢測閾值。 有趣的是，這個通過抗體測試評估其COVID-19抗體效應(yīng)為陰性的患者，其IFN-γ/ IL-2效應(yīng)卻最強(qiáng)。

       所以從這項(xiàng)研究，我們發(fā)現(xiàn)一個有意思的現(xiàn)象，抗體滴度與T細(xì)胞反應(yīng)之間的相關(guān)性似乎是相反的：抗體反應(yīng)最低的三個患者（C4，C5和C7），卻具有最高的T細(xì)胞反應(yīng)，即FluoroSpot分析中出現(xiàn)最高的IFN-γ/ IL-2的分泌細(xì)胞。但是由于，目前各方面的研究受限，我們尚不能得出這種相關(guān)性是否與疾病發(fā)展非常重要的結(jié)論。同樣地，我們也還沒有與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的數(shù)據(jù)。然而，這些數(shù)據(jù)為我們提出了一個重要問題：新冠病毒肺炎發(fā)病中，T細(xì)胞和B細(xì)胞之間是相互影響，互相作用的。

       而一篇最新發(fā)表的論文（Ni et al，Immunity, 2020) 展示了中和抗體滴度與病毒特異性T細(xì)胞數(shù)量之間呈正相關(guān)，也就是說這種結(jié)論暫時與我們的發(fā)現(xiàn)相反。這可能是因?yàn)槭芟抻跇颖救巳旱囊?guī)模以及其疾病的嚴(yán)重程度等因素。但是，同樣在這篇文章中，也有一個康復(fù)期的病人樣本，抗體水平難以檢測到，使用IFN-γ ELISpot試劑盒卻檢測到了抗病毒作用的T細(xì)胞效應(yīng)。

       如上所述，該研究小組只是展示初步的研究成果。而Mabtech 公司與法國國家健康研究院、法國國家科學(xué)研究中心、蔚藍(lán)海岸大學(xué)等研究機(jī)構(gòu)的合作的、更大的研究項(xiàng)目還在進(jìn)行中，以評估了該測定法對COVID-19患者的診斷和預(yù)后價值。

       為了更好的幫助廣大研究者方便研究新冠病毒肺炎，2020年05月18日Mabtech剛剛推出新冠病毒肽庫，SARS-CoV-2 S1 S2 N成分明確的肽庫。該肽庫已通過FluoroSpot和ELISpot的驗(yàn)證，可以用于確診的新冠病毒康復(fù)患者的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）體外刺激。而這些多肽的選擇是基于最新發(fā)表的文章Ahmed et al. (Viruses) 2020 。在這篇文章中作者描述了具有T細(xì)胞陽性反應(yīng)的SARS-1抗原表位。甚至有一些表位對SARS-1 和 SARS-2都具有效應(yīng)。這些抗原表位即是建立肽庫的基礎(chǔ)。SARS-CoV-2 S1 S2 N成分明確的肽庫共含有41個多肽，是基于棘突蛋白（S1和S2）和核蛋白（N）合成的多肽，分別是31種MHC-I肽和10種MHC-II肽。        Purified PBMCs prepared from three individuals previously PCR-confirmed for SARS-CoV-2 and PMBC from one pre-COVID-19 healthy control were stimulated with Mabtech's SARS-CoV-2 S1 S2 N defined peptide pool (250,000 cells/well). PHA stimulation (50,000 cells/well) was used as positive control stimulus. Unstimulated cells (250,000 cells/well). The T cell response was analyzed on Mabtech IRIS using an IFN-γ/IL-2 FluoroSpot assay。
       Human IFN-γ ELISpot. CD8+ cells were purified from whole blood using CD8 FAB-TACS (IBA Lifesciences). Cells (300,000 cells/well) were added to a pre-coated Human IFN-γ ELISpot plate and incubated overnight in the presence or absence of Mabtech’s SARS-CoV-2 S1 S2 N defined peptide pool.

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