人肺類器官在COVID-19新冠藥物篩選中的運用
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2020年5月5日，由美國康奈爾醫(yī)院的Yuling Han團隊在生物學預印本bioRxiv中發(fā)表的題為《Identification of Candidate COVID-19 Therapeutics using hPSC-derived Lung Organoids》的文章，全球首次報道了用肺類器官模型研究COVID-19及其治療藥物的篩選。 |
| Part 1 誘導hPSC分化為肺類器官，肺類器官組織對SARS-CoV-2偽病毒感染敏感，且體內(nèi)外研究結(jié)果一致 |
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研究人員們使用多種細胞因子及小分子組合體外定向誘導hPSC分化，使之分化為定型內(nèi)胚層(DE)，再分化為前腸內(nèi)胚層(AFE)（前腸內(nèi)胚層含肺部祖細胞(LPs) )，最終誘導其分化為肺類器官。通過分析單細胞轉(zhuǎn)錄組特征，鑒定肺類器官細胞類型，如II型肺泡細胞(AT2細胞, SP-B+SP-D+ABCA3+)、I型肺泡細胞(AT1細胞, PDPN+APQ5+)、基質(zhì)細胞、增殖細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞(ASCL1+CALCA+)以及氣道上皮細胞等(圖1a)。
 圖1d ACE2和TMPRSS2在AT2細胞的表達(SFTPB、SFPTD和 ABCA3為AT2細胞的表面標志物)
研究人員使用表達SARS-CoV-2刺突糖蛋白的水皰性口炎病毒(VSV) - SARS-CoV-2偽病毒感染肺類器官。熒光素酶(LUC)活性檢測結(jié)果顯示SARS-CoV-2偽病毒能輕松入侵人hPSC誘導的肺類器官(圖1f)。  圖1f ARS-CoV-2偽病毒感染肺類器官熒光素酶(LUC)活性檢測結(jié)果 為了研究人類肺器官的體內(nèi)模型，研究人員將體外培養(yǎng)了25天的肺祖細胞(LPs)注射到免疫缺陷的NSG小鼠皮下，待其生長分化4個月后(圖1g)，成為具有肺泡組織樣結(jié)構(gòu)(圖1h)的異種移植體。免疫熒光染色結(jié)果顯示，在異種移植體中存在大量表達ACE2的SP-B+AT2細胞(圖1i)。  圖1g-i 小鼠體內(nèi)LPs誘導形成肺泡組織及組織內(nèi)AT2細胞鑒定
研究人員將SARS-CoV-2偽病毒注射入移植體，24小時后檢測到SP-B+AT2細胞熒光素酶(LUC)的表達顯著高于對照組(圖1j)。LPs誘導形成的肺異種移植體對SARS-CoV-2病毒感染同樣敏感。  圖1j SARS-CoV-2偽病毒感染肺異種移植體 Part 2 研究人員將肺類器官與SARS-CoV-2共培養(yǎng)，考察SARS-CoV-2感染肺類器后病理變化，感染24小時后，肺類器官中SARS-CoV-2 DNA及SARS-S蛋白含量顯著升高(圖2a,b)，RNA序列檢測結(jié)果證實了SARS-CoV-2的強勁復制。研究人員還發(fā)現(xiàn)肺類器官中趨化因子及細胞因子表達顯著上調(diào)，但并未檢測到I型和III型IFNs。
 圖2 a,b 肺類器官中SARS-CoV-2 DNA及SARS-S蛋白含量檢測結(jié)果基因集合富集分析(GSEA)結(jié)果顯示，感染的肺類器官多條信號通路上調(diào)，如TNF信號通路、IL-17信號通路、趨化因子信號通路等，其中IL-17信號通路的上調(diào)與COVID-19患者肺組織的檢測結(jié)果相一致(圖2f, h)。以上研究結(jié)果均表明人肺類器官模型可以作為研究SARS-CoV-2感染以及致病機制的工具。
 圖2f hPSC誘導的肺類器官與對照組相比不同信號通路基因過表達分析  圖2h COVID-19患者與健康者相比不同信號通路基因過表達分析 Part 3
使用hPSC來源的肺類器官篩選治療COVID-19的候選藥物 為了明確能夠阻斷SARS-CoV-2偽病毒感染的候選藥物，研究人員將hPSC來源的肺類器官轉(zhuǎn)移至384孔板，培養(yǎng)6小時使其成團。選擇FDA批準的藥物以10 μM的濃度處理2小時后，將SARS-CoV-2偽病毒與肺類器官共培養(yǎng)，24小時后對類器官進行熒光素酶活性分析。選擇Z值<-2孔使用的藥物為候選藥物。對不同濃度的候選藥物進行藥物效力和細胞毒性分析(圖3e, f, g)。imatinib、mycophenolic acid(MPA)和quinacrine dihydrochloride(QNHC)三種藥物被證實不依賴于細胞毒性，以劑量依賴的方式阻斷SARS-CoV-2偽病毒感染。
 圖2e, f, g Imatinib, MPA, QNHC效力及細胞毒性檢測曲線 免疫熒光染色結(jié)果顯示，使用10 μM imatinib、3μM MPA或4.5 μM QNHC處理肺類器官，可顯著降低SARS-CoV-2偽病毒的感染率(圖3h)。  圖3h SARS-CoV-2偽病毒感染imatinib, MPA, QNHC處理過的肺類器官 為了評估藥物在體內(nèi)的抗病毒感染活性，研究人員將LPs注射到NSG小鼠皮下，待其4個月生長成熟后，將imatinib、MPA和QNHC分別注射入異種移植體內(nèi)，三小時后使用SARS-CoV-2偽病毒感染該移植體(圖3i)。24小時的免疫熒光檢測結(jié)果顯示，三種藥物均能阻止SARS-CoV-2偽病毒對AT2細胞的感染(圖3j)。
 圖3i LPs誘導形成肺泡組織的小鼠體內(nèi)給藥方案
 圖3j 體內(nèi)給藥后，SARS-CoV-2偽病毒感染肺異種移植體 類器官因其在結(jié)構(gòu)組織及功能上與體內(nèi)組織器官高度相似，可用于體外模擬體內(nèi)生理病理變化過程，因此選擇人肺類器官做為COVID-19藥物篩選的工具將會更加便捷。目前，已有三個使用imatinib治療COVID-19患者的臨床試驗(NCT04346147, NCT04357613，NCT04356495)注冊。使用類器官進行藥物篩選的研究可以更好地為臨床試驗提供數(shù)據(jù)支持。
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