如何選擇合適的液相色譜分離模式

自 1903 年，俄國植物學家米哈伊爾•茨維特發(fā)明色譜算起，色譜已走過 100 余年歷程。從最早正相色譜法，發(fā)展至今，諸多液相色譜分離模式：反相分離模式、親水分離模式、離子分離模式、體積排阻分離模式和親合分離模式等。因其具備多功能性和精確性，作為定性和定量的工具，液相色譜分析方法廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，如藥物質(zhì)量控制、食品營養(yǎng)物質(zhì)和添加劑檢測、環(huán)境揮發(fā)性有機物檢測、法醫(yī)毒物司法鑒定、臨床質(zhì)譜代謝物監(jiān)控與高性能材料配方測定等。

了解和理解液相色譜分離模式，有助于液相色譜分析相關(guān)工作的開展和深入。 液相色譜分離機理，本質(zhì)上是分析物在流動相與固定相之間作用力差異。對于樣品分析，需要綜合組分性質(zhì)與分離目的，選擇合適的分離模式，便于獲取最佳分析結(jié)果。對于分離模式，簡介如下：
1.正相分離模式（Normal Phase）
茨維特發(fā)明色譜的植物色素分離實驗，即采用正相分離模式。
機理：組分在極性固定相上的吸附/解吸附過程。
正相之意源自固定相極性大于流動相極性。
固定相以硅膠/氧化鋁居多；流動相包括正己烷、石油醚、二氯甲烷、異丙醇等非極性和弱極性溶劑。
適合非極性與弱極性化合物分離、異構(gòu)體分析、復(fù)雜樣本分級以及特殊組分凈化等。
正相分離模式下容易在極性填料表面產(chǎn)生死吸附，導(dǎo)致較差的重現(xiàn)性；目前主要用于手性拆分和制備色譜。

如脂溶性維生素D2分析與維生素D組分凈化（GB 5009.82-2016 第四法食品中維生素D的測定）：  
2.反相分離模式（Reversed Phase）
機理：組分在疏水固定相與極性流動相之間分配差異（疏水相互作用）。
反相之意源自固定相極性小于流動相極性。
反相分離模式因其分辨率高、平衡速度快等優(yōu)勢，在所有液相分離模式中占據(jù)主要地位（約70%樣品分析采用反相分離模式）。  
固定相以疏水功能基團（C18/C8）鍵合填料居多；流動相包括水相（純水與緩沖液）、甲醇、乙腈、異丙醇、四氫呋喃等極性和中等極性溶劑。
適合極性化合物（耐純水反相填料，在高比例水相條件下，可實現(xiàn)令人滿意的保留和基線分離）、中等極性、弱極性和部分非極性化合物分離分析。
注意：對于部分可離子化組分分析，可通過添加離子對試劑的
方式，進行反相分析。  
3.親水分離模式（HILIC）
機理：組分在流動相與固定相表面富水層之間分配差異。
固定相以極性基團鍵合填料居多；流動相包括水相（純水與緩沖液）、甲醇、乙腈等極性與中等極性溶劑。
固定相與正相分離模式一致，流動相組成包含有機相和水相，故有含水正相的別稱。又因分離模式中作用力較多，國內(nèi)色譜理論界大拿至今不認可其作為單獨分離模式劃分。
親水分離模式起步較晚，但因其適合極性化合物分離分析，隨著生命科學迅速發(fā)展，應(yīng)用范圍逐步擴大，目前成為高極性化合物分析的重要手段。適用于極性化合物（如草甘膦、極性代謝物和糖鏈）、無機離子和親水肽段等。  
4. 其他分離模式
離子分離模式（Ion-Exchange），基于離子化合物與固定相離子化功能基團之間離子相互作用。適合離子化化合物的分析，如無機離子、氨基酸、有機酸、聚核苷酸和蛋白電荷異構(gòu)體等。
注意：3價離子不適合用離子分離模式進行分析，因其與固定相作用力過強，出現(xiàn)不保留或強保留甚至不出峰的情況。
體積排阻分離模式（Size-Exclusion），利用不同分子量組分在填料內(nèi)流經(jīng)路徑差異，實現(xiàn)分離。適用于低聚物組成、高分子化合物分子量測定與分布分析等。近年來在抗體藥物單聚體與多聚體分析、PEG偶聯(lián)分析等方面表現(xiàn)出卓越性能。
注意：該分離模式對于小分子之間的分析，分辨率極低，即使組分分子量差異在5倍以上。
親合分離模式（Affinity），利用受體與配體之間可逆特異性結(jié)合（復(fù)雜作用力），實現(xiàn)分離。經(jīng)典應(yīng)用，即是利用Protein A與IgG的Fc區(qū)域之間的親合作用，將Protein A鍵合在填料上，實現(xiàn)IgG類蛋白藥物的純化和濃度滴定。
親合分離模式（Affinity），利用受體與配體之間可逆特異性結(jié)合（復(fù)雜作用力），實現(xiàn)分離。經(jīng)典應(yīng)用，即是利用Protein A與IgG的Fc區(qū)域之間的親合作用，將Protein A鍵合在填料上，實現(xiàn)IgG類蛋白藥物的純化和濃度滴定。
離子分離模式、體積排阻分離模式（凝膠過濾）與親合分離模式，流動相均為含鹽緩沖液，可保證蛋白活性，特別適用于生物制藥行業(yè)。
 
小  結(jié)
液相色譜分析中，會遇到各種樣品組分，充分考慮分子性質(zhì)和分析目的等方面信息，選擇合適的分離模式。一般來講，

• 對于小分子分析首選反相分離模式；
• 對于極性化合物分析，可首選高比例水相條件下的反相分離模式，其次親水分離模式。
• 對于大分子分析，可選擇的分離模式較多， 反相、離子、體積排阻、親合與疏水等。
• 對于手性分子，尤其慎重選擇填料和分離模式。

色譜包括液相色譜是一門經(jīng)驗科學，用心思考，善加總結(jié)，隨著時間的積累，會加深對色譜的理解，綜合考慮各方面因素，拿出最好的實驗方案。