如何在PCR檢測(cè)過程中降低檢測(cè)結(jié)果假陰性概率

1. 什么是PCR技術(shù)？

PCR技術(shù)又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。
在新冠病毒檢測(cè)中，核酸檢測(cè)被定義為臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，RT-PCR技術(shù)被反復(fù)提到，它是一種將RNA反轉(zhuǎn)錄與PCR相結(jié)合的技術(shù)。首先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將提取到的RNA合成cDNA,再以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下不斷擴(kuò)增（變性-退火-延伸多個(gè)循環(huán)）合成目的片段并進(jìn)行分析。
 

1. PCR用水

PCR技術(shù)目前多搭配試劑盒使用，也有用戶自行制備反應(yīng)體系，無(wú)論哪個(gè)過程都需要使用水。無(wú)論是近年來(lái)季節(jié)性爆發(fā)的甲流乙流，還是目前全球都在經(jīng)歷的新冠病毒，在檢測(cè)過程中都涉及一個(gè)痛點(diǎn)，那就是如何盡可能提高核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，減少假陰性結(jié)果出現(xiàn)的可能性。
我們首先分析一下假陰性結(jié)果出現(xiàn)的可能性，以新冠病毒核酸檢測(cè)為例，假陰性的主要原因有：

• 病人病程：不同病程，患者體內(nèi)病毒載量不同
• 采樣部位：咽拭子，鼻咽拭子，痰液，肺泡灌洗液等不同采樣部位病毒載量均不同
• 采樣準(zhǔn)確性：拭子質(zhì)量，工作人員操作等
• 試劑盒的質(zhì)量：引物設(shè)計(jì)以及水質(zhì)控制

為了順利將提取到的RNA反轉(zhuǎn)錄并實(shí)現(xiàn)DNA的成功擴(kuò)增，必須抑制核糖核酸酶（RNases）的降解作用，如果試劑盒用水內(nèi)含RNases，將極有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。
 

1. 去除RNases的主要方法

• 高壓滅菌：即便是在180℃下高壓滅菌4h之后，RNases仍保持某些活性，且某些特定細(xì)菌失活會(huì)釋放更多的RNases
• DEPC法（二乙基焦碳酸酯處理法）：利用二乙基焦碳酸酯（DEPC）處理方法使化學(xué)酶失活是用來(lái)抑制水溶液中RNases活性的常見方法。然而，二乙基焦碳酸酯是一種可疑致癌物，處理須小心；同時(shí)該方法雖然能夠使酶永久失活，卻無(wú)法將其從水中去除，同時(shí)清除多余的DEPC過程中，會(huì)產(chǎn)生乙醇，二氧化碳等其他污染物。
• 超濾法：超濾是一種真正能夠從水溶液中清除RNases的方法。默克Milli-Q選用內(nèi)置在丙烯腈丁苯橡膠（ABS）外殼中的聚砜超過濾膜作為超濾柱的主要成分，在一定水流速一定濃度范圍內(nèi)，超濾具有充分的截留作用。超濾處理可有效取代DEPC處理方法生產(chǎn)無(wú)RNase水。

 
 

1. Milli-Q生產(chǎn)無(wú)RNases水解決方案：

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