熒光信號(hào)放大TSA優(yōu)秀替代品—PSA技術(shù)

       Power Styramide™信號(hào)放大（PSA™）是一種新穎的酶檢測(cè)信號(hào)放大方法，用于檢測(cè)細(xì)胞和組織中的低豐度靶標(biāo)。通過將iFluor™染料的卓越亮度和光穩(wěn)定性與多HRP介導(dǎo)的PSA™成像相結(jié)合，可產(chǎn)生明亮的熒光信號(hào)，其準(zhǔn)確性和靈敏度明顯高于傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)，免疫細(xì)胞化學(xué)和原位雜交技術(shù)。

 

       Power Styramide™信號(hào)放大（PSA）

 

       與酪酰胺信號(hào)放大（TSA）相似，PSA利用辣根過氧化物酶（HRP）的催化活性原位共價(jià)沉積熒光團(tuán)。 PSA自由基具有比酪胺自由基高得多的反應(yīng)性，使得PSA系統(tǒng)比傳統(tǒng)的TSA試劑更快，更穩(wěn)健和靈敏。與酪胺試劑相比，Styramide 綴合物具有以更高效率標(biāo)記靶標(biāo)的能力，因此產(chǎn)生顯著更高的熒光信號(hào)。PSA™成像技術(shù)可以輕松應(yīng)用于任何檢測(cè)過程中需要加入HRP的應(yīng)用中，例如IHC，ICC，IF，  原位雜交和ELISA。

 

 

       圖1.PSA™檢測(cè)方法檢測(cè)原理示意圖。使用常規(guī)的檢測(cè)方法，用未標(biāo)記的一抗和HRP-二抗綴和物檢測(cè)細(xì)胞或組織樣品。HRP催化標(biāo)記的Styramide™轉(zhuǎn)化為高活性的Styramide™自由基，這些自由基與酶位點(diǎn)上或附近的酪氨酸殘基共價(jià)結(jié)合。

 

PSA™成像系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)：

 

       每個(gè)HRP標(biāo)簽的多個(gè)Styramide™底物的快速催化和共價(jià)沉積所產(chǎn)生的Power Styramide™信號(hào)放大轉(zhuǎn)化成了許多實(shí)際優(yōu)勢(shì)，包括簡(jiǎn)單，靈敏度和特異性增強(qiáng)以及與其他技術(shù)的兼容性。Styramide™基團(tuán)的較高反應(yīng)活性，使其在HRP-靶標(biāo)相互作用位點(diǎn)更牢固，更快速地標(biāo)記，從而比TSA產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)和更好的空間分辨率。

 

       PSA™特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)：

 

       超靈敏的低豐度靶標(biāo)檢測(cè)，比IHC，ICC和IF方法高100倍

       高熒光強(qiáng)度，比酪酰胺（TSA）高10至50倍

       與其他熒光標(biāo)記，染色技術(shù)和PSA™成像試劑盒兼容，可進(jìn)行多重分析

       與放射線檢測(cè)相比，PSA™自由基具有更高的反應(yīng)活性，可提供更快的結(jié)果以及同等的靈敏度和分辨率

       保留珍貴的抗體，PSA™標(biāo)記可減少一抗使用量，也能達(dá)到同等水平的靈敏度

       PSA™成像試劑盒易于使用，并提供足夠的試劑用于100次測(cè)試

 

iFluor™594 Styramide™ （貨號(hào)45035）	AlexaFluor®594 tyramide（貨號(hào)11082）

 

       優(yōu)越的檢測(cè)靈敏度

 

       將PSA™成像應(yīng)用于免疫染色實(shí)驗(yàn)中，可以增加一抗稀釋度，而不會(huì)使測(cè)定靈敏度降低。此外，增加一抗稀釋度會(huì)降低非特異性背景信號(hào)，并克服固定方法不當(dāng)或目標(biāo)表達(dá)水平低引起的免疫標(biāo)記不足。

 

 

       圖3. Power Styramide™信號(hào)放大（PSA™）套件的靈敏度。固定，滲透并用不同濃度的兔抗微管蛋白一抗標(biāo)記HeLa細(xì)胞。廠商建議的稀釋度為1：500或2ug / ml。然后，在我們的iFluor™488 PSA™成像試劑盒中用山羊抗兔IgG，AlexaFluor®488標(biāo)記的酪酰胺或AlexaFluor®488標(biāo)記的山羊抗兔IgG的試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。在相同條件下（使用FITC濾光片組并在相同的曝光時(shí)間下進(jìn)行分析）從每種處理中捕獲細(xì)胞圖像。測(cè)量了相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度，并比較了不同檢測(cè)方法之間的熒光強(qiáng)度。

 

       多種PSA™多重染色

 

       PSA™系統(tǒng)經(jīng)過設(shè)計(jì)，可與其他熒光發(fā)生器，細(xì)胞和組織染色技術(shù)以及其他PSA™成像套件兼容，從而可以同時(shí)可視化多個(gè)目標(biāo)。與TSA和熒光二抗相比，PSA™的檢測(cè)閾值較低，還可以檢測(cè)在同一宿主物種中產(chǎn)生的，但信號(hào)之間無(wú)明顯串?dāng)_的兩個(gè)靶標(biāo)。PSA™成像兼容：

 

       熒光標(biāo)記和復(fù)染物（例如DAPI，Hoechsts）

       其他Styramide™試劑

       其他PSA™成像套件

       酪酰胺試劑和酪酰胺成像試劑盒

 

iFluor™488 PSA™試劑盒（貨號(hào)：45205）

iFluor™555 PSA™試劑盒（貨號(hào)45270）

DAPI （貨號(hào)17507）

合并后

 

       圖4.使用iFluor™PSA™成像試劑盒對(duì)甲醛固定，石蠟包埋的人肺腺癌依次進(jìn)行免疫染色。用兔抗EpCam抗體和帶有山羊抗兔IgG（目錄號(hào)45205）的iFluor™488 PSA™成像試劑盒標(biāo)記EpCam，然后洗滌。用小鼠抗Pan Keratin抗體標(biāo)記Pan-Keratin，iFluor™555 PSA™成像試劑盒帶有山羊抗小鼠IgG（目錄號(hào)45270）標(biāo)記。細(xì)胞核用DAPI（目錄號(hào)17507）標(biāo)記。在共聚焦顯微鏡上采集圖像。

 

       靈活的工作流程：與IHC，ICC，ISH和流式細(xì)胞儀兼容：

 

       PSA™成像技術(shù)可適用于能在其檢測(cè)方案中添加HRP的任何應(yīng)用，并且與免疫學(xué)應(yīng)用中常用的樣品類型和熒光成像平臺(tái)兼容。與傳統(tǒng)的IHC，ICC，ISH和FC應(yīng)用程序結(jié)合使用時(shí)，PSA™成像可顯著提高檢測(cè)靈敏度，而不會(huì)降低圖像分辨率或增加背景信號(hào)。

 

 

       1. 免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）

 

       HL-60細(xì)胞的CD45表面受體染色。Hl-60細(xì)胞用4％甲醛固定，通透并用0.2 µg / mL抗CD45一抗標(biāo)記。然后將細(xì)胞用iFluor™647 Styramide™染色，并使用Cy5濾光片拍攝的熒光圖像。

 

 

       2. 原位雜交（ISH）

 

       使用生物素化的PNA探針通過原位雜交對(duì)著絲粒進(jìn)行染色。使用標(biāo)準(zhǔn)方案將Jurkat細(xì)胞固定并透化，用鏈霉親和素HRP綴合物檢測(cè)每個(gè)染色體的著絲粒，并用iFluor 488苯乙烯酰胺試劑可視化，用DAPI染色細(xì)胞核。

 

 

 

 

       3. 流式細(xì)胞儀

 

       使用iF488標(biāo)記的山羊抗兔IgG方法，酪酰胺方法或苯乙烯酰胺方法對(duì)Jurkat細(xì)胞中的pAKT進(jìn)行流式細(xì)胞分析。苯乙烯酰胺擴(kuò)增方法的信號(hào)強(qiáng)度比山羊抗兔IgG-iFluor™488直接染色高10倍，比Alexa Fluor 488酪酰胺染料染色高5倍。

 

 

       PSA™成像工作流程：

 

       PSA™成像利用辣根過氧化物酶（HRP）的催化活性在原位生成目標(biāo)蛋白或核酸序列的高密度標(biāo)記。與IHC，ICC和ISH程序的常規(guī)工作流程相似，PSA™成像易于執(zhí)行，包括幾個(gè)簡(jiǎn)單的過程。在此工作流程中，將熒光二抗替換為多HRP標(biāo)記二抗，唯一的附加步驟是與標(biāo)記的Styramide™一起孵育。

 

       1.固定，透化和封閉細(xì)胞或組織樣品。用未標(biāo)記的一抗，生物素化一抗或生物素化核酸探針孵育樣品。

       2.加入HRP標(biāo)記二抗或HRP-鏈霉親和素偶聯(lián)物。

       3.添加iFluor™染料Styramide™工作溶液，進(jìn)行HRP催化的Styramide™沉積。

       4.裝入樣品并檢測(cè)信號(hào)。

 

 

       圖5. Power Styramide™信號(hào)放大（PSA™）的工作流程。通過類似于常規(guī)ICC和IHC方法的工作流程，PSA™試劑盒和Styramide™試劑可以通過幾個(gè)簡(jiǎn)單的步驟就可以對(duì)所需目標(biāo)物進(jìn)行靈敏檢測(cè)。

 

       Power Styramide™信號(hào)放大相關(guān)產(chǎn)品信息匯總：

 

Styramide™	貨號(hào)	Ex (nm)	Em (nm)	濾光片	消光系數(shù)	量子產(chǎn)率
iFluor™ 350 Styramide™	45000	345	442	DAPI	20,000	0.95
iFluor™ 488 Styramide™	45020	491	514	FITC	75,000	0.9
iFluor™ 546 Styramide™	45025	541	557	Cy3/TRITC	100,000	0.67
iFluor™ 555 Styramide™	45027	552	567	Cy3/TRITC	100,000	0.64
iFluor™ 568 Styramide™	45030	568	587	Cy3/TRITC	100,000	0.57
iFluor™ 594 Styramide™	45035	587	603	Cy3/TRITC	180,000	0.53
iFluor™ 647 Styramide™	45045	654	669	Cy5	250,000	0.25
iFluor™ 680 Styramide™	45050	683	700	Cy5	220,000	0.23
iFluor™ 700 Styramide™	45055	690	713	Cy7	220,000	0.23
iFluor™ 750 Styramide™	45065	759	777	Cy7	275,000	0.12
iFluor™ 790 Styramide™	45070	786	811	Cy7	250,000	0.13

 

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