實時熒光定量PCR檢測方法-SYBR Green I 法與TaqMan 探針法
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既然儀器已經(jīng)備好了，那么該怎樣選擇檢測方法呢？
眾所周知，qPCR依托于熒光檢測技術(shù)，通過使用DNA結(jié)合染料、熒光PCR引物或探針等實時監(jiān)測目的基因的擴增，從而對目的基因進行定量分析。為了避免在實驗時出差錯，下面就跟著小編一起來看一下常用的經(jīng)典方法吧~
1、 DNA結(jié)合染料—SYBR Green I 法
• 原理：SYBR Green I 是一種DNA結(jié)合染料，其與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強，DNA與染料結(jié)合所釋放的熒光量與dsDNA的數(shù)量成正比。因此，檢測到的熒光信號可反映出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。
• 特征：可逆熒光，最大吸收波長497nm，最大發(fā)射波長520nm。
• 適用情況：非特異性的熒光染料，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈（包括非特異性擴增產(chǎn)物、引物二聚體等）就會結(jié)合發(fā)光，在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。但該方法容易建立實驗體系，可進行熔點分析，通用性好，價格相對較低，在科研中使用比較普遍。
2 、TaqMan 探針法
• 原理：檢測時除了需要一對特異性引物外，還需要一條與靶序列互補配對的寡核苷酸鏈—TaqMan探針，其5’末端包含熒光報告基團R，3’末端為淬滅基團Q。當探針與靶序列互補配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅基團接近而淬滅。在進行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’核酸外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。熒光信號和產(chǎn)物的量相匹配。
• 特征：檢測到的是積累熒光，隨著循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。
• 適用情況：特異性較強，可進行多重qPCR分析，但成本較染料法要高一些，實驗構(gòu)建相對復雜。常用的熒光基團推薦：FAM、VIC、HEX、CY5等。
3 、分子信標(molecular beacon)
• 原理：分子信標方法在檢測時除了需要一對引物以外，還需要一條呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針（25-40nt），分子信標的 5'端附有熒光報告基團，3'端附有淬滅基團，環(huán)被設(shè)計成與靶序列互補的15–30核苷酸，其兩端各有5-7個核苷酸互補形成莖結(jié)構(gòu)，將報告基團與淬滅基團連接到一起。發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，由于報告基團接近淬滅基團，監(jiān)測不到熒光信號，當環(huán)的部分與核酸序列互補配對，分子信標打開成鏈狀，使得熒光基團與淬滅劑分開，發(fā)射熒光。
• 特征：莖環(huán)結(jié)構(gòu)，也是積累熒光。
• 適用情況：高特異性、可以用于多重反應(yīng)，適合區(qū)分等位基因。但不能做熔點分析；發(fā)夾的莖結(jié)合過強過弱都不合適，過強的話，信標不能與靶標正確雜交，過弱的話，會隨機折疊成非發(fā)夾結(jié)構(gòu)，導致產(chǎn)生雜信號。常用的熒光基團有FAM 、Texas Red等。
4 、熒光共振能量傳遞(FRET)
• 原理：FRET探針又稱雙雜交探針，由兩條相鄰探針組成。第一個探針3'端帶有供體基團，第二個探針的5'端帶有受體基團，在PCR反應(yīng)的退火步驟，兩條探針頭尾相連地分別雜交在靶標序列上，熒光分子接近，從供體到受體產(chǎn)生熒光共振能量傳遞，受體熒光信號的增加與擴增子出現(xiàn)的量成比例。
• 特征：由于FRET探針是靠近發(fā)光，所以檢測信號是實時信號，而非積累熒光。
• 適用情況：除引物外需要設(shè)計兩條探針，通用性不高；需挑選合適的供體及受體基團，供體基團發(fā)射波長與受體基團的激發(fā)波長需顯著重疊，而供體基團發(fā)射波長與受體基團的發(fā)射波長要明顯分離�？勺鋈埸c分析，特異性較強。
5 、 LUX Primers
• 原理：LUX (light upon extention) 引物是通過熒光標記的引物，使引物可以實現(xiàn)探針的功能。其原理和分子信標類似，LUX引物也是發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中一條引物3’端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生熒光信號。
• 特征：積累熒光；不需要額外設(shè)計探針。
• 適用情況：不能進行熔點分析，通用性比不上SYBR Green I。但不需要專門設(shè)計探針，同時不會受非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體的影響，特異性較SYBR Green I強。
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