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Illumina平臺(tái)測序文庫精確定量試劑盒的實(shí)用數(shù)據(jù)對(duì)比

瀏覽次數(shù)：999　發(fā)布日期：2020-6-19　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

生命體遺傳信息的快速獲得對(duì)于生命科學(xué)的研究有著十分重要的意義。第一代測序儀對(duì)電泳分離技術(shù)的依賴，使其難以進(jìn)一步提高分析的速度和并行化程度，也難以通過微型化降低測序成本。經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進(jìn)， 21世紀(jì)初，以Roche454技術(shù)、illumina公司的GenomeAnalyzer技術(shù)和ABI 公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測序技術(shù)誕生了。第二代技術(shù)大大降低了測序成本，還大幅度提高了測序速度并保持了高準(zhǔn)確性。其中，illumina公司的第一臺(tái)測序儀于2006年問世，之后開發(fā)出來一系列的測序儀，如 Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、HiseqX等，在準(zhǔn)確性、通量、成本和速度方面表現(xiàn)更優(yōu)秀，而使其成為全球使用量最大的第二代測序儀。

近幾年來，包括人、擬南芥以及水稻等越來越多的基因組被測序，全基因組測序?yàn)橹匾虻目寺�、基因的系統(tǒng)進(jìn)化和基因組學(xué)研究提供了堅(jiān)實(shí)的平臺(tái)。但依然有部分珍貴物種由于樣本較少獲取難度大，或者個(gè)體較小獲得的基因組濃度較低等原因，得到的基因組DNA少(低于50ng)，按照目前現(xiàn)有的文庫定量及測序方法，準(zhǔn)確檢測的難度非常大。

測序文庫的定量分析和質(zhì)量評(píng)價(jià)對(duì)于獲得高質(zhì)量的核酸測序數(shù)據(jù)十分關(guān)鍵。因?yàn)椋?/div>

1.如果測序文庫拷貝數(shù)偏低，將不能獲得足夠的測序數(shù)據(jù)，導(dǎo)致降低數(shù)據(jù)產(chǎn)出;

2.如果測序文庫拷貝數(shù)過高，將產(chǎn)生低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，甚至?xí)䦟?dǎo)致測序失敗。

因此，要控制NGS測序儀上測序文庫的載入量，保證測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，就需要在測序前對(duì)DNA測序文庫進(jìn)行定量分析。

小艾為您推薦GeneCopeia 萌新產(chǎn)品Illumina 平臺(tái)測序文庫定量試劑盒--NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina® 。這是一種基于 qPCR 方法對(duì) Illumina 平臺(tái)測序文庫進(jìn)行 DNA 分子數(shù)絕對(duì)定量分析的試劑盒。它可以對(duì)兩端含有 Illumina P5、P7 芯片序列的各種類型 DNA 片段文庫進(jìn)行高特異性的快速定量，檢測結(jié)果靈敏度高，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，適用于大多數(shù)qPCR儀器。

Illumina 平臺(tái)測序文庫定量試劑盒優(yōu)勢：

靈敏度高—能檢出低至 0.0002 pM 的文庫樣品；

特異性強(qiáng)—使用抗體修飾法熱啟動(dòng) DNA 聚合酶，避免了 PCR 擴(kuò)增前的非特異性結(jié)合；文庫定量引物采用特殊算法設(shè)計(jì)，不會(huì)形成引物二聚體；

擴(kuò)增范圍廣—能檢測平均片段長度 1 kb 以內(nèi)的文庫；

擴(kuò)增效率高（E>0.92），實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好（R2>0.99）。

Illumina 平臺(tái)測序文庫定量試劑盒包含以下四種成分：

文庫DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品（qPCR DNA standard for Illumina）：經(jīng)過梯度稀釋的六份十倍比梯度稀釋的雙鏈DNA片段溶液（20 pM-0.0002 pM），經(jīng)過絕對(duì)定量和嚴(yán)格質(zhì)控，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線制作；

文庫定量引物（qPCR primer Mix for Illumina）：含有 Illumina P5，P7 芯片序列并經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計(jì)的一對(duì)qPCR引物；

2×qPCR預(yù)混液（2× BlazeTaq™ NGS qPCR Mix）：含有性能優(yōu)化的抗體修飾法DNA聚合酶、qPCR反應(yīng)緩沖液和SYBR Green染料等qPCR反應(yīng)所需成分；

ROX參比染料（ROX Reference Dye）。

Illumina 平臺(tái)測序文庫定量試劑盒性能數(shù)據(jù)展示

圖1. DNA標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線與熔解曲線。使用NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina®檢測6個(gè)10倍梯度稀釋的文庫DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品平行重復(fù)2次。結(jié)果顯示，試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的特性。

圖2. 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。使用NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina®擴(kuò)增文庫DNA標(biāo)準(zhǔn)品得到的qPCR產(chǎn)物，電泳分析無非特異擴(kuò)增現(xiàn)象。

圖3.兩款試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比。將GeneCopoeia的NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina®和KAPA Library Quantification Kits for Illumina platforms的標(biāo)準(zhǔn)品用BlazeTaq NGS qMix在ABI ViiA 7進(jìn)行擴(kuò)增。兩套標(biāo)準(zhǔn)品擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合，對(duì)應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的△Ct＜0.3。

4：文庫擴(kuò)增效率: 對(duì)不同類型的10種illumina文庫使用NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina®分別檢測，每個(gè)文庫樣本進(jìn)行6個(gè)梯度的10倍稀釋，計(jì)算出的擴(kuò)增效率如上圖顯示，10個(gè)文庫的擴(kuò)增效率均在90%-110%的范圍內(nèi)，與擴(kuò)增DNA標(biāo)準(zhǔn)品的效率相近。

產(chǎn)品名稱	描述	貨號(hào)	規(guī)格
NGSquant™ Library qPCR kit for Illumina®	用于Illumina 二代測序平臺(tái)的文庫定量試劑盒	QP100	500 rxns
NGSquant™ DNA Standard for Illumina^®	文庫DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品(濃度：20 – 0.0002 pM）	QP101	80 μL/管

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