PCR疑難問題粉碎機(jī)：逆轉(zhuǎn)錄PCR的操作要點(diǎn)與方法

     【前情回顧】PCR疑難問題粉碎機(jī)（一）——終點(diǎn)PCR

     【前情回顧】PCR疑難問題粉碎機(jī)（二）——熒光定量PCR

 

       逆轉(zhuǎn)錄 PCR（Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR）是一種以 RNA 為樣本，RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ) DNA（cDNA），再以此為模板通過 PCR 進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增。在實(shí)際應(yīng)用中，RT-PCR 分為一步法 RT-PCR 和兩步法 RT-PCR。整個反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過程有三個重要的因素，分別是RNA模板、反轉(zhuǎn)錄時所使用的引物類型、反轉(zhuǎn)錄酶 。

 

       RNA模板

 

       高質(zhì)量的 RNA 基本有幾個參數(shù)可供參考，首先是 OD260/280 以及 OD260/230的值應(yīng)該都是 2.0 左右，如果 OD260/280 小于 1.9，說明 RNA 中有一些蛋白質(zhì)的殘留，如果這個值大于 2.1，則很可能樣本中 RNA 有一定的降解。OD260/230如果小于 2.0，說明 RNA 中含有異硫氰酸胍，酚殘留，而這些物質(zhì)對逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)影響是非常大的。另外就是瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整性，正常的 RNA一般呈現(xiàn)三條帶，即 5s、18s、28s，其各自的亮度呈現(xiàn)遞增狀態(tài)，依據(jù)物種不同可逆轉(zhuǎn)錄 PCR能存在些許差異。當(dāng) RNA 出現(xiàn)降解時，反饋?zhàn)蠲黠@的是 5s rRNA 的亮度顯著提高。下圖展示的分別是高質(zhì)量 RNA、稍有降解以及完全降解的實(shí)例：

 

       反轉(zhuǎn)錄引物

 

       提取到了高質(zhì)量的 RNA模板后，下一個需要考慮的問題便是引物的選擇了。通常，反轉(zhuǎn)錄引物有三類，分別是 oligodT、隨機(jī)引物和序列特異性引物：oligodT引物能特異性結(jié)合在含有 polyA 尾的 mRNA 末端起始反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但這一特性決定了它只能擴(kuò)增含有 polyA 尾的 mRNA，而且對 RNA 模板的質(zhì)量要求較高，一旦 polyA 尾發(fā)生降解，就不能被引物所識別，從而導(dǎo)致產(chǎn)物中沒有相應(yīng)基因的cDNA；隨機(jī)引物一般含有 6-9 個隨機(jī)序列的堿基，能夠隨機(jī)識別結(jié)合在 RNA 模板上，因此這類引物的優(yōu)點(diǎn)在于能同所有類型的 RNA 結(jié)合，而且比較適合于含有二級結(jié)構(gòu)的 RNA 及微量樣本，具有較高的反轉(zhuǎn)錄靈敏度。

 

       但缺點(diǎn)在于，結(jié)合的隨機(jī)性會造成 cDNA小片段較多，有時候還會對微量目的片段造成稀釋；序列特異性引物，顧名思義，針對于特定的序列設(shè)計(jì)的反轉(zhuǎn)錄引物，用于特異性的反轉(zhuǎn)錄某一段序列。在實(shí)際的應(yīng)用中，我們通常會研究同一個個體或細(xì)胞中不同基因表達(dá)水平的變化，因此序列特異性基因相對用的少一些。Solis BioDyn 可供的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液中可提供多種不同的引物（oligodT、隨機(jī)引物、以及 oligodT 與隨機(jī)引物的結(jié)合）供您選擇，滿足您的一切實(shí)驗(yàn)需求！

 

 

       逆轉(zhuǎn)錄酶

 

       Solis BioDyn 可提供兩種逆轉(zhuǎn)錄酶：分別是 MMLV（RNase H+）和 SOLIScript（RNase H-）逆轉(zhuǎn)錄酶。RNase H，是一種核糖核酸內(nèi)切酶，可以特異性地水解DNA-RNA 雜合鏈中的 RNA，不能水解單鏈或雙鏈 DNA 或 RNA。

 

 

類型		貨號	名稱
逆轉(zhuǎn)錄酶		06-13-00050	FIREScript KIT RNase H+ 逆轉(zhuǎn)錄酶
		06-33-00050	SOLIScript KIT RNase H- 逆轉(zhuǎn)錄酶
cDNA第一鏈合成		06-17-00100	FIREScript RT cDNA syntesis MIX without primers cDNA合成預(yù)混液，無引物
		06-18-00100	FIREScript RT cDNA syntesis MIX with Oligo (dT) primer cDNA合成預(yù)混液，Oligo引物
		06-19-00100	FIREScript RT cDNA syntesis MIX with Random primers cDNA合成預(yù)混液，隨機(jī)引物
		06-20-00100	FIREScript RT cDNA syntesis MIX with Oligo (dT) and Random primers cDNA合成預(yù)混液，Oligo及隨機(jī)引物
miRNA(加尾法）		QP113	All-in-OneTM miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 2.0 miRNA cDNA 合成試劑盒
		QP010	All-in-OneTM miRNA qPCR Kit miRNA qPCR檢測試劑盒
		QP115	All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit 2.0 miRNA qRT-PCR檢測試劑盒
一步法RT-qPCR	染料法	QP071	BlazeTaq One-Step SYBR Green RT-qPCR Kit （with ROX） RT-qPCR試劑盒,ROX
		QP081	BlazeTaq One-Step SYBR Green RT-qPCR Kit （without ROX） RT-qPCR試劑盒,無ROX
	探針法	QP076	BlazeTaq Probe One-Step RT-qPCR Kit （with ROX） RT-qPCR試劑盒,ROX
		QP086	BlazeTaq Probe One-Step RT-qPCR Kit （without ROX） RT-qPCR試劑盒,無ROX
		08-65-00250	SOLIScript 1-step CoV Kit RT-qPCR試劑盒
		08-59-00250	SOLIScript 1-step Multiplex Probe Kit (ROX) RT-qPCR試劑盒,ROX
		08-61-00250	SOLIScript 1-step Multiplex Probe Kit (Purple) RT-qPCR試劑盒,Purple
在線客服	雷雷		閃閃

 

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       艾美捷科技有限公司，通過提供完整的產(chǎn)品和服務(wù)體系、便利的客戶關(guān)系和供應(yīng)鏈管理，為生命科學(xué)研究工作者提供整體打包方案。我們的企業(yè)的核心價值觀：“激情、敬業(yè)、學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓越”。激發(fā)我們內(nèi)在的創(chuàng)造力，提供有競爭力的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品和服務(wù)，持續(xù)為客戶創(chuàng)造最大價值是我們的企業(yè)使命。我們的企業(yè)愿景是成為受人尊重、世界一流的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品及服務(wù)供應(yīng)商。

 

       作為一家具有尖端的技術(shù)實(shí)力、一流的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)，總部位于武漢光谷國家級高新技術(shù)開發(fā)區(qū)，服務(wù)面向全國。艾美捷科技是集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，為用戶提供最前沿的專業(yè)資訊、完備的產(chǎn)品、整合的解決方案，及優(yōu)質(zhì)的物流服務(wù)。為了更好的服務(wù)客戶，公司組建了一支經(jīng)驗(yàn)豐富的研發(fā)團(tuán)隊(duì)-艾美捷生物技術(shù)中心，進(jìn)入研發(fā)生產(chǎn)階段，將更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品推薦給國內(nèi)生物領(lǐng)域的同仁們!

 

       艾美捷科技與國內(nèi)外優(yōu)秀的生物試劑供應(yīng)商保持著密切的合作關(guān)系，目前已成為眾多國際知名品牌的中國總代理或一級代理，主要包括：AmyJet、AAT Bioquest、Abnova、Agrisera、Biovision、Biosensis、Cayman Chemical、Caisson Labs、Cytoskeleton、CytoNiChe、Epigentek、Equitech-Bio、Hycult Biotech、Jackson、LifeSensors、ProSpec、Norgen Biotek、Mabtech、Matreya、iRegene、StressMarq、ImmunoReagents、SouthernBiotech、Origene、US Biological、Solis BioDyne等，可以在第一時間為用戶提供最前沿的專業(yè)資訊、完備的產(chǎn)品及物流服務(wù)。

 

       三點(diǎn)：

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       六觀：

       價值觀：激情、敬業(yè)、學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓越。