從新冠疫情看分子診斷POCT的發(fā)展

     疾病檢測技術(shù)一直處于高速發(fā)展的過程中，越來越多的手段使人類對疾病的診斷日漸精準(zhǔn)。但是，準(zhǔn)確率更高的檢測手段通常意味著更高的成本、更長的時間、更繁復(fù)且條件苛刻的診斷流程，這使得臨床往往在面對高度傳染性疾病時陷入兩難的境地，即大規(guī)模確診病人的緊迫性與捉襟見肘的高端檢測資源相沖突。

在此次新冠疫情面前，常見檢測手段的局限性就暴露無遺，由于診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”分子診斷對試劑、設(shè)備、場地、操作人員要求都很高，檢測集中在三級以上醫(yī)院及各大三方檢測中心中，資源非常有限，最終在檢測能力不足以快速識別所有患者的情況下，為切斷傳染鏈只能對所有人采取停工、停學(xué)等手段，極大的影響到日常經(jīng)濟(jì)活動和生活。

同樣的，世界醫(yī)學(xué)最發(fā)達(dá)的日本、美國等國家地區(qū)也無法擺脫檢測試劑不足、檢測成本高昂等問題。如果能有兼顧高準(zhǔn)確率、低成本、操作簡易、用時短等特點(diǎn)，適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用的檢測手段，無疑將大大提高防疫效率。

實(shí)際上，分子診斷方法不僅僅在提高準(zhǔn)確度、通量等方向進(jìn)步，也在努力朝著小型化、自動化、高速化、簡易化等方向發(fā)展，推動分子診斷實(shí)現(xiàn)去中心化的目的，普惠基層醫(yī)療。在這其中，得益于恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)的使用，已經(jīng)誕生了一批符合基層條件的分子診斷POCT產(chǎn)品，包括此次疫情中也催生了不少相關(guān)產(chǎn)品，值得我們深入探討和研究。
 

01、分子診斷的必要性  

傳染性疾病的診斷方法有培養(yǎng)法、免疫檢驗(yàn)、分子檢驗(yàn)、質(zhì)譜檢驗(yàn)等，綜合效率、成本、準(zhǔn)確率、使用難度等各方面因素考量，免疫檢測和分子檢測是當(dāng)前最為主要的兩種診斷方法。

此次新冠肺炎的診斷也以分子診斷和免疫檢測為標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)《新冠病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》（“診療方案”），新冠肺炎患者有3種確診方法：“1. 實(shí)時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性；2. 病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源；3. 血清新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽性；血清新型冠狀病毒特異性IgG抗體由隱性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高”。

其中前2種方法為分子診斷，第3種為免疫檢驗(yàn)。值得注意的是，第3種檢測方法是在最新一版診療方案中才被加入，分子診斷的權(quán)威性則是在一開始就被確立。

免疫診斷雖然有成本低、操作難度低、檢測速度快等優(yōu)勢，天然適合普及基層使用，但其對檢測有明顯的窗口期要求，必須在患者產(chǎn)生抗體后才能有效，這又與傳染病確診的緊迫性相矛盾。

大部分傳染病在發(fā)病初期的傳染性最強(qiáng)，但免疫診斷在此時又難以確診，容易錯失防疫的重要時機(jī)。

相比之下，分子診斷雖然成本高、操作要求高，但窗口期要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫檢驗(yàn)，在面臨重大傳染性疾病時，及時性和準(zhǔn)確率才是最重要的考慮因素，并沒有其他更好的選擇。

分子診斷又可被分為核酸擴(kuò)增技術(shù)、基因芯片、基因測序等多類技術(shù)，其中以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為主的核酸擴(kuò)增技術(shù)由于敏感性、特異性表現(xiàn)優(yōu)秀，操作相對簡單且成本低，性價比最高，成為當(dāng)前最普及的核酸診斷方法。而基因芯片、基因測序則由于技術(shù)難度大、設(shè)備投入大、試劑成本過高等原因，當(dāng)前還不具備大規(guī)模使用的基礎(chǔ)。在此次疫情中，實(shí)時熒光PCR技術(shù)就成為使用量最大的診斷方法。
 

02、PCR的局限性有突破空間  

雖然實(shí)時熒光PCR技術(shù)成為此次疫情中最為主要的確診手段，但其本身具有的局限性也在阻礙著檢驗(yàn)產(chǎn)能的提高，造成疫情初始時檢驗(yàn)資源嚴(yán)重不足的局面。

首先，PCR操作流程繁瑣，導(dǎo)致檢驗(yàn)效率低且用時過長。簡單而言，PCR需要通過反復(fù)升降溫，循環(huán)“加溫-退火-延伸”步驟進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增通常需要1-2個小時的時間，加上前期樣本處理、提取的流程，總體操作時間往往要超過3個小時，效率低下。并且，上述繁瑣的流程也使得PCR檢驗(yàn)對操作人員要求較高，基層并無足夠數(shù)量的相關(guān)人員配備。

其次，PCR對操作場地有嚴(yán)格要求。由于PCR反應(yīng)過程中不斷進(jìn)行升溫、降溫，樣本液體蒸發(fā)后冷凝，容易在空氣中形成攜帶大量樣本DNA的氣溶膠，進(jìn)而污染其他樣品。因此，PCR檢驗(yàn)需要專門的PCR實(shí)驗(yàn)室，將試劑配制、標(biāo)本處理、擴(kuò)增和分析等操作流程區(qū)分開，并通過控制空氣流動方向以保證空氣清潔度。一個PCR實(shí)驗(yàn)室往往需要數(shù)百萬元的資金投入，這是基層無法負(fù)擔(dān)的，因此我國PCR檢測主要集中在三級以上醫(yī)院和三方大型檢測中心中。

從問題出發(fā)，要解決核酸檢驗(yàn)難以在基層普及的問題，簡化操作流程、實(shí)現(xiàn)操作的全自動化、設(shè)備的全集成化勢在必行�？上驳氖牵�恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)的使用，使突破這些局限因素成為可能性。

恒溫?cái)U(kuò)增是一種建立在PCR基礎(chǔ)上開發(fā)的核酸擴(kuò)增手段。通過加入特殊設(shè)計(jì)的酶和引物，恒溫?cái)U(kuò)增無需反復(fù)升降溫，只需要一個溫度即可完成擴(kuò)增。相比PCR，恒溫?cái)U(kuò)增不僅僅是操作步驟更簡單，其對儀器設(shè)備的要求很低，反應(yīng)速度被大大縮短至1小時以內(nèi)。從20世紀(jì)90年代恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)被提出后，截止當(dāng)前全世界共有十多種常見的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，包括環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)(TMA)、酶促重組等溫?cái)U(kuò)增法（ERA）等，其原理也不盡相同。

通過恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用，使分子診斷POCT產(chǎn)品成為可能。一方面，擴(kuò)增的流程被簡化。由于技術(shù)原理限制，PCR的升降溫固有流程難以改變，但是，無需熱變的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)只需要一個溫度即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，大大縮短檢驗(yàn)時間。另一方面，全自動化、全集成的檢驗(yàn)操作正在被逐步實(shí)現(xiàn)。通過集成樣本處理、核酸提取、擴(kuò)增、檢測所有步驟，再加上全自動化的操作體驗(yàn)，不僅僅使得操作流程更加簡易，還能摒除人為因素的干擾，提升結(jié)果準(zhǔn)確率，好處顯而易見。

但是，在生化、免疫等其他各類檢測手段都已經(jīng)實(shí)現(xiàn)全自動化的今天，核酸檢驗(yàn)還遲遲未能實(shí)現(xiàn)全自動化，最主要的原因是核酸檢驗(yàn)靈敏度過高，要求各模塊密閉，對設(shè)備的設(shè)計(jì)要求很高；同時PCR又需要反復(fù)升降溫，嚴(yán)苛的溫度環(huán)境對本就精密性要求極高的設(shè)備進(jìn)一步提出挑戰(zhàn)，因此全自動PCR產(chǎn)品開發(fā)難度極高。

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展在一定程度上削弱了上述要求的影響。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不需要升降溫環(huán)節(jié)，各個反應(yīng)模塊實(shí)現(xiàn)封閉化，即解決了交叉污染的問題，又使得流程更為簡單，同時對反應(yīng)條件和設(shè)備要求也都有所降低。
 

03、恒溫?cái)U(kuò)增應(yīng)是核酸POCT檢測的新方向  

對于疫情的防控，抗體檢測更適用于大量疑似病例和無癥狀感染者的檢測，感染者通常在感染1-2周后，才能在抗體檢測中呈陽性結(jié)果，因此，單獨(dú)抗體檢測不能作為確診或排除感染的依據(jù)。核酸檢測較血清抗體檢測的優(yōu)勢在于縮短了感染檢出窗口期，可及早發(fā)現(xiàn)感染者，是目前確診感染的首選方法，也是“金標(biāo)準(zhǔn)”，通過大范圍的核酸檢測更能保證疫情的有效控制。

POCT是指在采樣現(xiàn)場進(jìn)行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到檢測結(jié)果的一種檢測方式。POCT是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要領(lǐng)域，具有快速檢測、現(xiàn)場采樣、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。

通過恒溫?cái)U(kuò)增分子POCT的方式，核酸檢測打破了只能在PCR實(shí)驗(yàn)室做的局限，將應(yīng)用場景拓展到出入境、機(jī)場、火車站、基層醫(yī)療單位等，從而代替一部分免疫檢測的市場空間。一方面是各種不需要復(fù)雜的熱循環(huán)設(shè)備的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)逐步代替PCR技術(shù)成為擴(kuò)增手段；另一方面代替了傳統(tǒng)的核酸提取和加樣配液等復(fù)雜耗時的人工操作，而大大縮短了檢測時間，降低了操作門檻。

3月底時，美國媒體報(bào)道了雅培公司利用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，研發(fā)出了號稱目前檢測速度最快的新冠病毒核酸檢測產(chǎn)品。陽性結(jié)果最快可在5分鐘 內(nèi)獲得，陰性結(jié)果可在13分鐘 內(nèi)確認(rèn)，在國際上引起了巨大轟動，甚至連美國總統(tǒng)特朗普和FDA局長都為其“直播帶貨”，一時間名聲雀起，就連普通民眾都在談?wù)摗?/span>

我國在這一領(lǐng)域雖然起步稍晚，但也已經(jīng)引起足夠的重視，在恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，酶促重組等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ERA技術(shù)），它具有低溫適應(yīng)性，而且在反應(yīng)速度、靈敏度、準(zhǔn)確性等方面有了極大的突破。該技術(shù)在低溫條件下（25-42℃）可對極微量的病原體的基因片段進(jìn)行特異性的快速擴(kuò)增，10-15分鐘可將目標(biāo)基因片段精準(zhǔn)復(fù)制數(shù)十億倍，只需20 min，就能完成現(xiàn)場檢測并出具報(bào)告，極大縮短了檢測時間。目前也已成功研制出“新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（RT-ERA熒光檢測法）”。

這些企業(yè)和產(chǎn)品的成功，預(yù)示著核酸檢測在我國會隨著此次疫情的顛覆性效應(yīng)迅速擴(kuò)大市場影響力，而其中能夠適應(yīng)現(xiàn)場檢測的POCT產(chǎn)品會獲得更好的增長空間。

 

04、總結(jié)  

在各項(xiàng)檢驗(yàn)技術(shù)中，分子診斷有著其他檢驗(yàn)手段難以比擬的高敏感性和特異性，更憑借幾乎無窗口期限制的優(yōu)勢，成為急性傳染病檢驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是分子診斷一直以來是“高大上”的代言詞，由于種種技術(shù)局限性，造成基層難以普及，也無法在大規(guī)模疫情發(fā)展下發(fā)揮應(yīng)有的作用。

所幸，得益于恒溫?cái)U(kuò)增等各項(xiàng)新技術(shù)的發(fā)展并和分子診斷技術(shù)融合，普惠化的分子診斷產(chǎn)品逐步成為可能。我們也欣喜的看到，雖然分子診斷POCT行業(yè)仍然處于萌芽期當(dāng)中，但此次抗疫并不缺乏分子診斷POCT產(chǎn)品的身影。

此次面對新冠疫情檢測資源嚴(yán)重不足的局面足以為我們敲響警鐘，分子診斷POCT產(chǎn)品值得更多的扶持和鼓勵，我們未來需要更好的武器去抗擊傳染病。