未來(lái)可期-CAR-T細(xì)胞療法的發(fā)展及展望

圖1：T細(xì)胞活化雙信號(hào)

CAR-T細(xì)胞療法治療的原理是通過(guò)基因工程技術(shù)將識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原(Tumor associated antigen,TAA) 的抗體可變區(qū)基因序列與胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列在體外進(jìn)行重組(形成CAR),再通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染方式將編碼CAR基因的重組質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)進(jìn)已分離出的患者T淋巴細(xì)胞中，使T細(xì)胞表面表達(dá)能識(shí)別腫瘤抗原的受體蛋白，經(jīng)體外大規(guī)模培養(yǎng)擴(kuò)增后表達(dá)特異性嵌合抗原受體的T細(xì)胞稱為CAR-T細(xì)胞[2]。由于治療使用的Ｔ細(xì)胞來(lái)源于患者的外周血細(xì)胞，整個(gè)治療過(guò)程沒有免疫排斥反應(yīng)。當(dāng)大量CAR-T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后，CAR能特異性地識(shí)別靶向腫瘤細(xì)胞的抗原，活化后的Ｔ細(xì)胞可以殺傷腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。

根據(jù)CAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，對(duì)CAR的設(shè)計(jì)研究已經(jīng)進(jìn)行到了第五代[3]。初代CAR設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單，由單鏈抗體通過(guò)跨膜區(qū)域與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM,Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)相連,ITAM通 常為CD3ζ或FcεRIγ,第一代CAR設(shè)計(jì)的信號(hào)域是單一的信號(hào)分子，而腫瘤細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)減弱或者缺失,因此CAR修飾的T細(xì)胞缺乏共刺激-第二信號(hào)的支持,T細(xì)胞激活后很快由于信號(hào)限制而喪失作用，這使得第一代CAR-T細(xì)胞在患者體內(nèi)抗腫瘤效果有限[4]。作為改進(jìn),二代CAR在前一代的基礎(chǔ)上引入了一個(gè)共刺激分子(如CD28，4-1BB，OX40等),用來(lái)激活第二信號(hào)，提供雙重活化信號(hào)從而加強(qiáng)CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷毒性，這明顯的改善了第一代CAR對(duì)T細(xì)胞激活不充分的缺點(diǎn)[5, 6]；三代CAR則在二代的基礎(chǔ)上引入多個(gè)共刺激分子(如CD28、CD137、OX40等)，多種共刺激分子相互組合可以增強(qiáng)Ｔ細(xì)胞內(nèi)的JNK、NK-kB等信號(hào)通路，使得T細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)更持久的作用活性，這對(duì)增加T細(xì)胞的抗腫瘤活性、延長(zhǎng)T細(xì)胞的增殖能力、生存周期及促進(jìn)細(xì)胞因子(如IL-2、IFN-γ、TNF-α等)的分泌等方面均有顯著的提升。但臨床上第三代CAR研究較少，且三代CAR會(huì)造成T細(xì)胞刺激閾值降低，可能引起活化信號(hào)的泄露，從而誘發(fā)細(xì)胞因子釋放過(guò)量，因此具體作用是否比二代CAR效果好還需要進(jìn)一步研究[7]。四代CAR屬于新型研究，相比三代CAR其整合了一個(gè)活化T細(xì)胞核因子轉(zhuǎn)錄相應(yīng)元件，它可以使CAR-T細(xì)胞在腫瘤區(qū)域分泌特定的細(xì)胞因子(例如IL-12)，從而可以提高了T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的存活率，招募并活化其它免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境中進(jìn)行免疫應(yīng)答[8]。五代CAR-T就是通用型CAR-T，它以基因編輯技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)可以阻止人體發(fā)生排異反應(yīng)的基因，并且可以進(jìn)行異體Ｔ細(xì)胞的提前制備，隨時(shí)提供給患者。但就臨床應(yīng)用來(lái)看，第二代CAR-T細(xì)胞療法仍為主流。圖2為CAR發(fā)展歷程圖。

2.CAR-T在實(shí)體瘤中的應(yīng)用
相比于血液系統(tǒng)腫瘤，實(shí)體瘤中CAR-T的應(yīng)用受到更多因素的限制，一方面，實(shí)體瘤發(fā)生部位不像血液系統(tǒng)散布全身，CAR-T細(xì)胞需抵達(dá)實(shí)體瘤病灶，并浸潤(rùn)到腫瘤內(nèi)部，即使CAR-T細(xì)胞能夠浸潤(rùn)到實(shí)體瘤內(nèi)部，也會(huì)面臨其內(nèi)部免疫微環(huán)境的抑制，影響T細(xì)胞正常發(fā)揮作用；另一方面，實(shí)體瘤內(nèi)部微環(huán)境存在偏酸、缺氧及營(yíng)養(yǎng)缺乏等情況，也不利于CAR-T細(xì)胞發(fā)揮作用。此外，實(shí)體腫瘤缺乏較理想的特異性表面抗原，且具有不同的免疫抑制機(jī)制，因此CAR-T細(xì)胞免疫治療在實(shí)體瘤的療效不及血液腫瘤(特別是B細(xì)胞惡性腫瘤)，但其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肉瘤、間皮瘤、胰腺癌等腫瘤中取得了較好的療效。由June博士領(lǐng)導(dǎo)的小組在臨床實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)靶向間皮素(Mesothelin)的CAR mRNA瞬轉(zhuǎn)入病人T細(xì)胞中，回輸CAR-T細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)1例胰腺癌轉(zhuǎn)移的晚期病人和1例晚期間皮瘤病人，均獲得顯著治療效果，沒有任何脫靶毒性發(fā)生[9]。HER2基因是受體酪氨酸蛋白激酶家族的成員，在很多腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)并且在上皮細(xì)胞上也有表達(dá)，在臨床實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)采用第二代CAR-T靶向HER2來(lái)治療表達(dá)HER2的腫瘤患者[10]。另外，由于腫瘤新生血管與腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，應(yīng)用靶向新生血管中過(guò)表達(dá)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFＲ-2)的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行腫瘤免疫治療，能夠抑制小鼠不同的腫瘤生長(zhǎng)，且對(duì)正常組織無(wú)明顯損傷，進(jìn)而可以發(fā)揮間接抗腫瘤作用[11, 12]。

3.CAR-T 細(xì)胞療法面臨的挑戰(zhàn)
CAR-T細(xì)胞在腫瘤免疫治療方面擁有很多優(yōu)勢(shì)，它可以利用非限制性的形式特異識(shí)別和殺傷表達(dá)特定抗原的癌細(xì)胞，以單鏈抗體(single chain antibody fragment，scFv)作為抗原識(shí)別區(qū)段的CAR能夠識(shí)別不同種類的抗原，包括糖類和脂類等非蛋白抗原，腫瘤表面的脂類抗原也可以作為靶點(diǎn)，而不再僅局限于蛋白類抗原。這擴(kuò)大了腫瘤抗原靶點(diǎn)范圍。此外，CAR-T細(xì)胞還可以分泌多種細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)其在體內(nèi)的持續(xù)增殖，對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異識(shí)別殺傷作用，同時(shí)，這些細(xì)胞因子還可以改變腫瘤免疫微環(huán)境對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用。盡管有著諸多優(yōu)勢(shì)，然而，新療法不可避免的會(huì)產(chǎn)生一些新問(wèn)題，特別是在治療過(guò)程出現(xiàn)的嚴(yán)重毒副作用，其中以細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)最頻繁、癥狀最突出。另外，脫靶效應(yīng)、神經(jīng)毒性以及插入突變都會(huì)影響CAR-T的最終療效。

● 細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）
細(xì)胞因子釋放綜合征(Cytokine releasesyndrome，CRS)也稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴，它是CAR-T臨床應(yīng)用中最顯著的不良反應(yīng)，嚴(yán)重的CRS出現(xiàn)概率為27%~53%，常發(fā)生于接受細(xì)胞治療后6~20天[6, 13]。其發(fā)生機(jī)制是靜脈輸入CAR-T細(xì)胞后，在短時(shí)間內(nèi)清除腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥因子，如細(xì)胞因子、趨化因子，這些炎癥因子會(huì)引起炎癥反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷，甚至引起死亡。臨床表現(xiàn)主要有發(fā)熱、乏力、疲勞、心動(dòng)過(guò)速、低血壓、毛細(xì)血管滲透綜合性以及心功能不全、彌漫性血管內(nèi)凝血等癥狀[14]。目前關(guān)于細(xì)胞因子風(fēng)暴造成的不良反應(yīng)，解決方案主要有：使用糖皮質(zhì)激素藥物(如氫化可的松)來(lái)抑制細(xì)胞因子分泌；使用靶向阻斷刺激細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物（如IL-6受體抑制劑）[15]；引入可控性自殺基因(如caspase9或者HSV-TK)作為安全開關(guān)，在出現(xiàn)急性毒性時(shí)，可以快速誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡并逆轉(zhuǎn)GVHD。另外，有研究構(gòu)建一種默認(rèn)為關(guān)閉狀態(tài)，只有在調(diào)控藥物作用下才會(huì)開啟的“On Switch”CAR-T細(xì)胞，用以控制CAR-T作用的時(shí)間和劑量，提高治療的安全性[16]。還有研究顯示，CRS 與疾病進(jìn)程或腫瘤負(fù)荷相關(guān)，在疾病負(fù)荷高的患者體內(nèi)CRS更嚴(yán)重，因此在疾病惡化之前進(jìn)行CAR-T回輸治療可降低CRS的風(fēng)險(xiǎn)[6]。

● 脫靶效應(yīng)
脫靶效應(yīng)是CAR-T療法最主要的毒副作用之一。CAR-T細(xì)胞與腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen, TAA)具有高度的親和性，當(dāng)正常組織與腫瘤細(xì)胞都表達(dá)同一種抗原時(shí)，CAR-T細(xì)胞無(wú)法區(qū)分，在攻擊腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)攻擊正常細(xì)胞。如果靶抗原分子是嚴(yán)格的腫瘤特異性表面分子，就可避免脫靶效應(yīng)的發(fā)生，但真正的腫瘤特異性分子到目前還非常少，因此，尋找僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的靶抗原是CAR技術(shù)應(yīng)用的首要任務(wù)。此外，通過(guò)設(shè)計(jì)多個(gè)抗原復(fù)合的CAR結(jié)構(gòu)，識(shí)別抗原組合，提高殺傷的特異性也可降低脫靶效應(yīng)的發(fā)生概率，比如同時(shí)靶向抗原ErbB2和MUC1的CAR-T治療乳腺癌。腫瘤細(xì)胞的基因常常不穩(wěn)定，一旦靶抗原丟失就會(huì)逃離CAR的識(shí)別，而間質(zhì)細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組分，直接影響腫瘤細(xì)胞，且基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，故有研究選擇基質(zhì)細(xì)胞作為CAR殺傷對(duì)象，間接作用腫瘤細(xì)胞，以應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞基因不穩(wěn)定突變。

● 神經(jīng)系統(tǒng)毒性
接受CAR-T治療的B-ALL患者中29%~43%可發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)[17]。CAＲ-T治療白血病也可能引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。臨床研究報(bào)道這種神經(jīng)系統(tǒng)毒性表現(xiàn)多樣，如譫妄、嗜睡、語(yǔ)言障礙、運(yùn)動(dòng)障礙、不同程度的腦病癥狀和癲癇發(fā)作[2, 18]。Maude等在接受CAR-T治療的B-ALL患者腦脊液中發(fā)現(xiàn)了CAR-T，提示神經(jīng)毒性可能與患者腦脊液中出現(xiàn)CAR-T細(xì)胞相關(guān)[2]。此外，JUNO公司進(jìn)行的JCAＲ015Ⅱ期臨床試驗(yàn)中， 在20余例患者中先后有3例出現(xiàn)因神經(jīng)毒性作用導(dǎo)致的死亡事件；分析認(rèn)為患者可能存在白血病細(xì)胞入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病(Central nervous system leukemia，CNSL)，導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞，大量腫瘤細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)在腦組織中迅速裂解，從而形成腦部水腫; 因此在臨床治療中應(yīng)排除CNSL患者。CAR-T治療引起的神經(jīng)毒性癥狀通常是自現(xiàn)性的，多數(shù)患者神經(jīng)系統(tǒng)障礙可在短期內(nèi)恢復(fù)，且沒有后遺癥。使用妥珠單抗或皮質(zhì)類固醇激素?zé)o法明顯緩解神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀，其背后的發(fā)生機(jī)制未明。

● 插入突變
CAR-T技術(shù)是在T細(xì)胞中插入一段外源的DNA片段，理論上說(shuō)其結(jié)構(gòu)已被破壞，存在一定的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。雖然目前并沒有關(guān)于基因改造T細(xì)胞致瘤性的報(bào)道，但研究者還是一直關(guān)注此問(wèn)題的發(fā)生，也在不斷通過(guò)優(yōu)化載體的類型和轉(zhuǎn)染的方式來(lái)降低插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，某些研究中心已采用mRNA直接轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的方法來(lái)避免風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生[19]。此外，CAR-T療法存在其它的不良反應(yīng)，包括：過(guò)敏反應(yīng)，移植物康宿主病(GVHD)，腫瘤溶解綜合征等。

4.CAR-T細(xì)胞療法未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)
一是治療效果待提高。僅從短時(shí)間內(nèi)的治療效果看，CAR-T療法對(duì)某些血液腫瘤的治療效果十分顯著，但若將觀察期限進(jìn)一步延長(zhǎng)則發(fā)現(xiàn)，許多患者在經(jīng)過(guò)CAR-T治療幾個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間后，會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的現(xiàn)象，影響患者預(yù)后。因此提高CAR-T細(xì)胞激活程度，提高其增殖能力，并延長(zhǎng)CAR-T細(xì)胞在患者體內(nèi)的存活時(shí)間是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向之一。針對(duì)經(jīng)CAR-T治療后血液腫瘤可能再次復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，我們可以設(shè)計(jì)同時(shí)靶向CD19與CD22分子的雙特異性CAR-T，已有研究發(fā)現(xiàn)，在CAR-T治療過(guò)程中，一些原本表達(dá)CD19的癌細(xì)胞可能轉(zhuǎn)而表達(dá)CD22蛋白，因此CD19、CD22雙管齊下，理論上能夠增強(qiáng)CAR-T的效果。當(dāng)前，改善CAR-T療法在實(shí)體瘤中的治療效果面臨巨大的阻礙。
二是CAR-T的產(chǎn)業(yè)化。CAR-T療法費(fèi)用昂貴。目前，已獲批的CAR-T產(chǎn)品和絕大多數(shù)CAR-T臨床試驗(yàn)都是使用自體型CAR-T，即以患者自身的T細(xì)胞為起始材料，這種“私人訂制”療法的生產(chǎn)成本較高。諾華、Kite 獲批的CAR-T 產(chǎn)品定價(jià)分別為47.5萬(wàn)美元、37.3萬(wàn)美元，高昂的價(jià)格限制了其市場(chǎng)潛力。諾華旗下的CAR-T產(chǎn)品在2018年第一季度取得了1200萬(wàn)美元的營(yíng)收，只達(dá)到了預(yù)期的三成；Kite的CAR-T產(chǎn)品在獲批后兩個(gè)月內(nèi)的銷售額也不及預(yù)期。除費(fèi)用高昂外，CAR-T療法質(zhì)量穩(wěn)定性也比較差�；颊咦陨淼腡細(xì)胞通常都存在質(zhì)量與數(shù)量的缺陷，不同批次產(chǎn)品之間質(zhì)量的穩(wěn)定性較差，難以達(dá)到大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)及標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量控制。
三是降低CAR-T細(xì)胞毒性。CAR-T療法表現(xiàn)出的毒副作用說(shuō)明，需要開發(fā)一些控制程序來(lái)調(diào)控CAR的活性。目前已經(jīng)有大量方法用于控CAR-T的安全性，比如通過(guò)安裝自殺開關(guān)對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行快速清除，這種開關(guān)可通過(guò)小分子或者抗體來(lái)控制。常用的自殺開關(guān)包括可誘導(dǎo)的caspase-9(iCasp9)、單純皰疹病毒中的胸苷激酶(HSV-TK)及自殺表位等。但自殺開關(guān)也會(huì)清除治療性的CAR-T細(xì)胞，引發(fā)治療反應(yīng)的不可逆終止。因此，不清除CAR-T細(xì)胞的非細(xì)胞毒性的可逆系統(tǒng)對(duì)于控制毒性反應(yīng)也許是有用的。
四是開發(fā)通用型CAR-T。目前全球主要有十幾家公司從事通用型CAR-T開發(fā)。該技術(shù)主要依賴于基因編輯平臺(tái)，使用CRISPR技術(shù)敲除T細(xì)胞中引起免疫排斥的基因，將其制成沒有免疫排斥的、只特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化T細(xì)胞，使CAR-T轉(zhuǎn)變?yōu)?ldquo;off-the-shelf”的藥品，與高成本“私人定制”的CAR-T不同，通用型CAR-T將會(huì)具備能規(guī)�；�生產(chǎn)、劑量恒定、療效優(yōu)越等優(yōu)點(diǎn)。目前，雖然大多數(shù)通用CAR-T的研發(fā)還處在臨床前或臨床早期階段，但其極具吸引力的治療潛力足以作為繼續(xù)研發(fā)的強(qiáng)大推動(dòng)力。通用型CAR-T的上市將會(huì)大大降低CAR-T療法的成本，使這項(xiàng)技術(shù)惠及更多的病人。
CAR-T細(xì)胞療法是一直免疫細(xì)胞治療領(lǐng)域的焦點(diǎn)，極有希望徹底改變某些腫瘤(特別是血液腫瘤)的臨床治療現(xiàn)狀，美國(guó)是全球最早開啟CAR-T細(xì)胞治療臨床實(shí)驗(yàn)的國(guó)家，2010年以前，全球CA-T細(xì)胞治療臨床注冊(cè)實(shí)驗(yàn)都集中在美國(guó)開展，我國(guó)從2012年起開始了CAR-T細(xì)胞治療臨床注冊(cè)，每年新注冊(cè)的CAR-T項(xiàng)目以數(shù)倍的速度爆發(fā)式增長(zhǎng)，目前已成為全球CAR-T細(xì)胞療法臨床實(shí)驗(yàn)注冊(cè)數(shù)量最多的國(guó)家，但是CAR-T細(xì)胞療法在技術(shù)上和臨床應(yīng)用上仍然存在著許多亟待解決的問(wèn)題。希望通過(guò)醫(yī)藥企業(yè)、臨床醫(yī)生、政府監(jiān)管部門三方共同努力，建立高水準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)化治療流程以及制定一系列的法規(guī)政策，推動(dòng)我國(guó)CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)臨床應(yīng)用的快速發(fā)展，為醫(yī)學(xué)發(fā)展和人類健康做出貢獻(xiàn)。

圖3：CAR-T生產(chǎn)過(guò)程

5.CAR-T研究相關(guān)產(chǎn)品

1）CAR-T活化：CD3和CD28激發(fā)型抗體

2）CAR-T擴(kuò)增：無(wú)動(dòng)物成分重組細(xì)胞因子

3）CAR-T鑒定：預(yù)包被的ELISA試劑盒

 參考文獻(xiàn)