Naica數(shù)字PCR在朊病毒感染的組織中IP10、KC和M-CSF表達(dá)增加的應(yīng)用

近日中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所朊病毒實(shí)驗(yàn)室，在Virologica Sinica雜志上發(fā)表“IP10, KC and M-CSF is Remarkably Increased in the Brains from the Various Strains of Experimental Mice Infected with Different Scrapie Agents”。該研究采用了Luminex、ELISA、IHC和RT-PCR等多種方法，發(fā)現(xiàn)IP10、KC和M-CSF轉(zhuǎn)錄及翻譯水平在不同羊瘙癢癥感染嚙齒類動(dòng)物模型大腦中其含量顯著升高，且與小鼠的遺傳背景無關(guān)。這項(xiàng)研究旨在探究炎癥細(xì)胞因子和趨化因子與朊病毒疾病的相關(guān)性，這些數(shù)據(jù)使我們對(duì)朊病毒感染期間的炎癥反應(yīng)和朊病毒疾病的進(jìn)展有了更好的了解。該雜志2020年影響因子3.242。（詳情請(qǐng)見文末）

文獻(xiàn)內(nèi)容

朊病毒疾病

癢病由亞病毒中的朊病毒所致，是一種長期的進(jìn)行性、衰竭性與致死性的神經(jīng)疾病。朊病毒病(PrDs)是由聚集的感染性朊病毒蛋白(朊病毒)錯(cuò)誤折疊引起。散發(fā)性克雅氏病(sCJD)則是人類最常見的朊病毒疾病，在人和動(dòng)物的朊病毒病中觀察到類似的神經(jīng)病理學(xué)特征。腦內(nèi)朊病毒的沉積與皮質(zhì)海綿狀變性、神經(jīng)元丟失以及小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活躍膠質(zhì)增生有關(guān)，而小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞。膠質(zhì)細(xì)胞作為先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其活化后產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子可能參與了朊病毒病的進(jìn)展。

在朊病毒疾病的大腦中反復(fù)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的異常升高，其中包括促炎性細(xì)胞因子IL1a、 IL1b 、TNF、IL6 以及抗炎細(xì)胞因子TGFb、IL4 和IL10 等。研究發(fā)現(xiàn)，在感染癢病菌株22L的小鼠中IP10和KC發(fā)生上調(diào)。IP10作為一種趨化因子，與受體CXCR3結(jié)合并激活多種信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥因子流入感染或炎癥組織。在朊病毒感染過程中，IP10介導(dǎo)的信號(hào)通路被激活，包括Erk1/2和JNK通路。與IP10一樣，KC也屬于趨化因子CXC家族，與炎癥、血管生成、腫瘤發(fā)生廣泛相關(guān)，并參與神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，M-CSF由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成，但鮮有研究報(bào)道M-CSF在朊病毒發(fā)病機(jī)制中的變化情況。

實(shí)驗(yàn)室介紹

朊病毒病室實(shí)驗(yàn)室隸屬于病毒病預(yù)防控制所，病毒病預(yù)防控制所是中國疾病預(yù)防控制中心下屬的獨(dú)立法人機(jī)構(gòu)。其前身為1949年成立的中央衛(wèi)生研究院病毒系，后于1964年成立中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所，原隸屬于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。1983年，病毒學(xué)研究所劃歸中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院。2002年1月23日，病毒學(xué)研究所正式更名為中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，簡稱病毒病所。

朊病毒病室實(shí)驗(yàn)室的主要研究方向：擬訂朊病毒病預(yù)防控制相關(guān)的規(guī)章規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)、技術(shù)指南及方案預(yù)案等提供科學(xué)依據(jù)；應(yīng)對(duì)人類及動(dòng)物朊病毒病疫情和突發(fā)公共衛(wèi)生事件提供技術(shù)支持，參與和指導(dǎo)地方相關(guān)疫情和突發(fā)公共衛(wèi)生事件的調(diào)查和處置；組織開展全國人類朊病毒病監(jiān)測工作，收集、分析、解釋、報(bào)告和反饋監(jiān)測數(shù)據(jù)，評(píng)價(jià)和改進(jìn)監(jiān)測系統(tǒng)；協(xié)調(diào)與國家瘋牛病監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)工作；開展監(jiān)測、檢測技術(shù)研究和技術(shù)貯備，為各級(jí)疾控機(jī)構(gòu)的朊病毒病預(yù)防控制工作提供技術(shù)指導(dǎo)；開展朊病毒病原學(xué)、流行病學(xué)、遺傳學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、個(gè)體生物學(xué)等科學(xué)研究及朊病毒病致病機(jī)理的研究，開展相應(yīng)的診斷、預(yù)防和治療等生物技術(shù)研究，開展其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的研究；建立和完善人類朊病毒病參比實(shí)驗(yàn)室，開展朊病毒病相關(guān)毒種和生物樣本等資源的保藏和相關(guān)生物安全研究；開展朊病毒病相關(guān)的研究生教育培養(yǎng)和全國疾控人員的專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)，開展相關(guān)的國際合作與交流，參與朊病毒病的預(yù)防控制和研究工作；承擔(dān)上級(jí)交辦的其他各項(xiàng)工作。

摘 要

在朊病毒疾病患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，經(jīng)常觀察到炎癥細(xì)胞的激活和一些細(xì)胞因子的上調(diào)。為了評(píng)估朊病毒感染過程中一些很少被處理的腦細(xì)胞因子的潛在變化，該研究首先通過Luminex實(shí)驗(yàn)篩選了感染不同癢病病株的小鼠腦中17種不同細(xì)胞因子的水平。在許多感染癢病小鼠的腦裂解液中檢測到IP10、KC和M-CSF顯著上調(diào)。ELISA和免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這三種細(xì)胞因子在癢病感染小鼠大腦中的表達(dá)上調(diào)。qRT-PCR和數(shù)字PCR檢測到感染癢病小鼠大腦中IP10、M-CSF和KC的特異性mRNA的增加。對(duì)感染后不同時(shí)間點(diǎn)采集的腦標(biāo)本進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)這三種細(xì)胞因子的增加呈時(shí)間依賴性，特別是在癢病感染潛伏期的IP10。此外，還發(fā)現(xiàn)45例散發(fā)性克雅氏病(sCJD)患者腦脊液(CSF)中IP10的水平略高于未診斷為朊病毒病的患者。

文中對(duì)感染小鼠大腦組織中的IP10轉(zhuǎn)錄本的絕對(duì)數(shù)量，使用的Naica數(shù)字PCR進(jìn)行檢測，方法描述如下所示：

如下圖所示，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和數(shù)字PCR對(duì)各種瘙癢病感染的小鼠模型中IP10，KC和M-CSF的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較分析。

A：相對(duì)于單個(gè)β-actin的轉(zhuǎn)錄水平，確定了IP10，KC和M-CSF特異性mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

B：感染139A，ME7的小鼠和對(duì)照組的大腦IP10 DNA拷貝數(shù)。

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https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12250-020-00216-3

Naica數(shù)字PCR平臺(tái)

法國Stilla Technologies Naica數(shù)字PCR平臺(tái)是實(shí)現(xiàn)DNA/RNA絕對(duì)定量的技術(shù)工具，自動(dòng)生成單層平鋪的微滴，進(jìn)行單分子PCR擴(kuò)增，通過高分辨率的三色熒光通道檢測，自動(dòng)QC質(zhì)控，識(shí)別三色熒光中有效的陰陽性微滴，從而達(dá)到目的DNA/RNA的絕對(duì)定量檢測。同時(shí)提供原始數(shù)據(jù)、單微滴追溯等功能，確保數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

☑ 只需一步加樣操作，無需標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線是真正的絕對(duì)定量系統(tǒng)。通過對(duì)模板的有限稀釋，耐受抑制劑能力強(qiáng)，更有利于臨床、環(huán)境等復(fù)雜樣本的檢測。
☑ 有效微滴數(shù)~30000/樣本，實(shí)現(xiàn)低濃度、低豐度的核酸樣本進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
☑ 封閉式芯片設(shè)計(jì)，樣本間獨(dú)立，避免了加樣交叉污染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)防止擴(kuò)增后的氣溶膠污染，保證結(jié)果安全可靠和實(shí)驗(yàn)環(huán)境安全。

期刊介紹

Virologica Sinica是中國科學(xué)院主管，中國科學(xué)院武漢病毒研究所和中國微生物學(xué)會(huì)共同主辦的學(xué)術(shù)期刊，創(chuàng)刊于1986年，2007年變更為英文全球出版。近年來，在主辦單位的大力支持下，在主編、編委會(huì)專家和審稿專家的學(xué)術(shù)引領(lǐng)和無私奉獻(xiàn)中，VS逐步成長為SCI期刊，并連續(xù)七年（2013-2019年）獲得“中國最具國際影響力學(xué)術(shù)期刊”稱號(hào)。在辦刊過程中，我刊始終堅(jiān)持“提高論文質(zhì)量，縮短出版周期，擴(kuò)大國際影響”；聚焦病毒學(xué)學(xué)科熱點(diǎn)及前沿領(lǐng)域，組織刊發(fā)高水平論文及�？�；為廣大作者提供優(yōu)質(zhì)高效的論文編輯服務(wù)，為高水平論文發(fā)表提供綠色通道。