有效評(píng)估疫苗引起細(xì)胞免疫的效應(yīng)-IFN-γ ELISpot法

       自新冠肺炎疫情爆發(fā)以來(lái)，至今已有大半年時(shí)間。目前尚無(wú)任何直接有效的藥物能阻止疫情蔓延。疫苗的研發(fā)進(jìn)程可能直接決定了這場(chǎng)抗疫戰(zhàn)的持續(xù)時(shí)間。全球研究學(xué)者對(duì)新冠病毒疫苗的研究也正在如火如荼地開展。

 

 

       5月22日，醫(yī)學(xué)期刊《柳葉刀》發(fā)表了我國(guó)軍事醫(yī)學(xué)研究院陳薇院士和江蘇省疾控中心朱鳳才教授團(tuán)隊(duì)的新冠疫苗人體試驗(yàn)臨床數(shù)據(jù)結(jié)果。為了評(píng)估COVID-19 Ad5重組疫苗的有效性，科研人員抽取疫苗注射14天及28天的志愿者血液進(jìn)行如下幾個(gè)方面的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：

 

       ELISA-檢測(cè)血清中抗體針對(duì)COVID-19病毒Spike蛋白及RBD區(qū)域的結(jié)合作用；

       疫苗誘導(dǎo)的中和抗體應(yīng)答通過(guò)COVID-19病毒中和試驗(yàn)和假病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)；

       IFN-γ Elispot檢測(cè)PBMC的免疫響應(yīng)（使用Spike重組糖蛋白分別刺激疫苗接種前后同一志愿者體內(nèi)PBMC，接種后細(xì)胞分泌IFN-γ程度是接種前2倍即認(rèn)為成功產(chǎn)生免疫效應(yīng)）；

       流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4 T cell及CD8 T cell經(jīng)Spike重組糖蛋白刺激后產(chǎn)生的IL-2、IFN-γ及TNFα；

 

       除針對(duì)新冠病毒的Ad5重組蛋白疫苗外，其他病毒的重組蛋白疫苗、滅活疫苗、DNA疫苗等在進(jìn)入臨床或者臨床前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究中，都是選擇的IFN-γ ELISpot方法評(píng)估疫苗引起的細(xì)胞免疫效應(yīng)。為什么是ELISpot這種方法，不是ELISA?為什么是IFN-γ這個(gè)指標(biāo)，不是其他的細(xì)胞因子？

 

       為什么是ELISpot？

 

       在免疫學(xué)領(lǐng)域中，相關(guān)疾病和疫苗的研究等均是基于體液的免疫應(yīng)答（Humoral Mediated Immune Response，HMI）和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答（Cell Mediated Immune Response，CMI）為基礎(chǔ)。在以往的免疫應(yīng)答研究機(jī)制中常使用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）來(lái)檢測(cè)體液中游離的細(xì)胞因子或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或細(xì)胞因子的半衰期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，因此ELISA并不能真實(shí)反映體內(nèi)抗體及細(xì)胞因子的實(shí)際水平。

 

       自1983年，Sedgwick和Czerkinsky結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和ELISA技術(shù)，建立了體外檢測(cè)特異性分泌抗體細(xì)胞（Antibody-Secreting Cells， ASCs）和分泌細(xì)胞因子（Cytokine，CK）細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISpot），可從單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌抗體細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子細(xì)胞的一項(xiàng)細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。由于該法及高靈敏度，特異性強(qiáng)，高通量，單細(xì)胞水平，功能性檢測(cè)以及低成本等諸多優(yōu)點(diǎn)于一身，是研究Th1/Th2的反應(yīng)，疫苗研制，病毒感染的檢測(cè)和治療，腫瘤學(xué)，傳染性疾病，自身免疫性疾病和器官移植的理想工具。

 

       為什么是IFN-γ？

 

       IFN-γ作為免疫活性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在誘導(dǎo)抗病毒免疫中起著重要的免疫調(diào)理作用，包括激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）細(xì)胞和吞噬細(xì)胞等，而在疫苗免疫后機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ的水平實(shí)際上反映輔助性T細(xì)胞的活動(dòng)。因此，檢測(cè)IFN-γ的水平就是間接地檢測(cè)輔助性T細(xì)胞活性。目前，檢測(cè)IFN-γ的水平已經(jīng)逐漸代替各種傳統(tǒng)的細(xì)胞免疫檢測(cè)手段，成為檢測(cè)細(xì)胞免疫效果的一種重要方法。

 

       因此，建立IFN-γ ELISpot檢測(cè)方法，可以作為檢測(cè)和評(píng)價(jià)疫苗細(xì)胞免疫的有效方法，目前也已成為疫苗引起的細(xì)胞免疫效應(yīng)評(píng)估的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

 

 

       IFN-γ Elispot技術(shù)原理：

 

       A.用抗IFN-γ的單克隆抗體包被在檢測(cè)孔的底部；

       

       B.分離待檢測(cè)樣本的淋巴細(xì)胞；

 

       C.將待測(cè)細(xì)胞放入檢測(cè)孔，同時(shí)加入刺激物。在培養(yǎng)期間，對(duì)刺激物有反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞就會(huì)被激活，開始分泌特定的細(xì)胞因子IFN-γ，這些細(xì)胞因子同時(shí)被板底的單克隆抗體捕獲；對(duì)刺激物沒(méi)有反應(yīng)的細(xì)胞則不受刺激，也不分泌特定的細(xì)胞因子IFN-γ;

 

       D.移出細(xì)胞，板底留下細(xì)胞因子的潛在“影像”;

 

       E.加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，檢測(cè)抗體與“影像”上的細(xì)胞因子結(jié)合，形成“抗體-抗原-抗體”的夾心結(jié)構(gòu)；

 

       E.加入鏈霉親和素標(biāo)記的酶溶液，通過(guò)鏈霉親和素與檢測(cè)抗體上標(biāo)記生物素結(jié)合，形成復(fù)合物；

 

       F.加入顯色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點(diǎn)；

 

       F.斑點(diǎn)計(jì)數(shù)（可人工計(jì)數(shù)，也可自動(dòng)讀板計(jì)數(shù)），數(shù)據(jù)處理，結(jié)果分析。每一個(gè)斑點(diǎn)代表了一個(gè)對(duì)特異抗原有反應(yīng)的特異性T淋巴細(xì)胞。斑點(diǎn)的數(shù)目多少就反映了樣本的細(xì)胞免疫的識(shí)別狀態(tài)：斑點(diǎn)多說(shuō)明免疫識(shí)別狀態(tài)好，斑點(diǎn)少說(shuō)明免疫識(shí)別狀態(tài)差或者出現(xiàn)免疫耐受。

 

       Mabtech可提供各種不同種屬的IFN-γ ELISpot試劑盒

 

 

       IFN-γ ELISpot試劑盒：

 

貨號(hào)	名稱	說(shuō)明
3420-2A	Human IFN-gamma ELISpotBASIC kit (ALP)	包被抗體；生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體；鏈霉親和素-ALP
3420-2APT-2	Human IFN-gamma ELISpotPRO kit (ALP)	陽(yáng)性對(duì)照品；預(yù)包被透明板；ALP標(biāo)記檢測(cè)抗體；底物(BCIP/NBT)
3420-2APW-2	Human IFN-gamma ELISpotPRO kit (ALP)	陽(yáng)性對(duì)照品；預(yù)包被白色板；ALP標(biāo)記檢測(cè)抗體；底物(BCIP/NBT)
3420-2AST-2	Human IFN-gamma ELISpotPRO kit (ALP), strips	陽(yáng)性對(duì)照品；可拆卸預(yù)包被透明板；ALP標(biāo)記檢測(cè)抗體；底物(BCIP/NBT)
3420-2H	Human IFN-gamma ELISpotBASIC kit (HRP)	包被抗體；生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體；鏈霉親和素-HRP
3420-2HPT-2	Human IFN-gamma ELISpotPRO kit (HRP)	陽(yáng)性對(duì)照品；預(yù)包被透明板；HRP標(biāo)記檢測(cè)抗體；底物(TMB)
3420-2HPW-2	Human IFN-gamma ELISpotPRO kit (HRP)	陽(yáng)性對(duì)照品；預(yù)包被白色板；HRP標(biāo)記檢測(cè)抗體；底物(TMB)
3420-2HST-2	Human IFN-gamma ELISpotPRO kit (HRP), strips	陽(yáng)性對(duì)照品；可拆卸預(yù)包被透明板；HRP標(biāo)記檢測(cè)抗體；底物(TMB)
3420-4APT-2	Human IFN-gamma ELISpotPLUS kit (ALP)	陽(yáng)性對(duì)照品；預(yù)包被透明板；生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體；鏈霉親和素-ALP；底物(BCIP/NBT)
3420-4APW-2	Human IFN-gamma ELISpotPLUS kit (ALP)	陽(yáng)性對(duì)照品；預(yù)包被白色板；生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體；鏈霉親和素-ALP；底物(BCIP/NBT)
3420-4AST-2	Human IFN-gamma ELISpotPLUS kit (ALP), strips	陽(yáng)性對(duì)照品；可拆卸預(yù)包被透明板；生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體；鏈霉親和素-ALP；底物(BCIP/NBT)
3420-4HPT-2	Human IFN-gamma ELISpotPLUS kit (HRP)	陽(yáng)性對(duì)照品；預(yù)包被透明板；生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體；鏈霉親和素-HRP；底物(TMB)
3420-4HPW-2	Human IFN-gamma ELISpotPLUS kit (HRP)	陽(yáng)性對(duì)照品；預(yù)包被白色板；生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體；鏈霉親和素-HRP；底物(TMB)
3420-4HST-2	Human IFN-gamma ELISpotPLUS kit (HRP), strips	陽(yáng)性對(duì)照品；可拆卸預(yù)包被透明板；生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體；鏈霉親和素-HRP；底物(TMB)

 

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