熱點(diǎn)課題研究之慢病毒載體的使用與技術(shù)展望

       在我們的課題研究中，很多小伙伴們應(yīng)該都涉及到基因功能的研究。在基因功能研究過程中，我們少不了要去給這個(gè)基因進(jìn)行過表達(dá)、敲除或者敲低的操作。這樣我們就需要構(gòu)建表達(dá)載體（過表達(dá)，敲除或者敲低），并將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至我們的細(xì)胞或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)，進(jìn)而便可研究我們的基因在細(xì)胞或者生物體內(nèi)所執(zhí)行的功能和扮演的角色。

 

       可在構(gòu)建表達(dá)載體的時(shí)候 ，我們要如何選擇合適自己實(shí)驗(yàn)需要的載體呢？載體可分為病毒載體和非病毒載體，病毒載體又分為慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關(guān)病毒載體等。今天我們就來說說病毒載體中的慢病毒載體。

 

       一、慢病毒

 

       逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）：是一種RNA病毒，在復(fù)制時(shí)需在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下首先將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA， 再在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等蛋白酶作用下擴(kuò)增。主要包括RNA腫瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三種亞科。

 

       慢病毒（Lentivirus）：屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，名稱源自該種病毒長(zhǎng)達(dá)數(shù)年的潛伏期。

 

       最經(jīng)典的慢病毒是由HIV病毒改造而來，而且HIV-1/HIV-2系統(tǒng)也得到了廣泛的應(yīng)用，除了HIV病毒系統(tǒng)以外，后續(xù)還有猿類免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）載體系統(tǒng)、貓免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）載體系統(tǒng)、綿羊梅迪-維斯納病毒（MMV）載體系統(tǒng)和馬傳染性貧血(EIA）載體系統(tǒng)等。

 

 

       慢病毒結(jié)構(gòu)：

 

       2個(gè)調(diào)節(jié)基因：

 

    （1）tat基因：反式激活因子，對(duì)HIV基因起正調(diào)控作用。

 

    （2）rev基因：病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子，增加gag和env基因?qū)�結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)。

 

       4個(gè)輔助蛋白（附屬）基因：

 

    （1）vif和vpu調(diào)節(jié)感染性病毒顆粒的產(chǎn)生；

 

     （2）vpr和nef參與疾病的表現(xiàn)。

 

 

       慢病毒的優(yōu)勢(shì)：

 

       1.慢病毒攜帶的基因組可整合到宿主基因組，使宿主細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)外源基因；

       2.可感染分裂和非分裂細(xì)胞；

       3.低免疫原性，直接注射活體組織不易造成免疫反應(yīng)，適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；

       4.可以更換特異性啟動(dòng)子；

       5.野生型的HIV大小約為9.8 kb，插入片段可長(zhǎng)達(dá)5-6 kb；

       

       二、慢病毒載體

 

       慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒�？衫�用逆轉(zhuǎn)錄酶將外源基因整合到基因組中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，具有感染分裂期與非分裂期細(xì)胞的特性。

 

       慢病毒載體組分：

 

       慢病毒載體系統(tǒng)：包裝成分和載體成分

 

       產(chǎn)生慢病毒顆粒的輔助成分：慢病毒包裝質(zhì)粒和包裝細(xì)胞系。

 

       慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。

 

       慢病毒包裝成分：由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白。包裝成分通常被分開構(gòu)建到兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。

 

       將包裝成分與載體成分的3個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞(如人腎293T細(xì)胞)，即可在細(xì)胞上清中收獲只有一次性感染能力而無復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。

 

       慢病毒包裝過程：

 

       慢病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中反轉(zhuǎn)錄為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生小RNA。慢病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)或小RNA干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂（圖1）。

 

 

慢病毒包裝和侵染細(xì)胞的過程（元和生物）

 

       三、慢病毒的使用和優(yōu)勢(shì)

 

       慢病毒的使用量的取決因素：滴度， 感染體積 ，MOI ，細(xì)胞密度

 

       滴度（Titer）：?jiǎn)挝惑w積液體中有感染能力的病毒或噬菌體數(shù)目。單位：TU/mL （活性滴度單位）、copies/mL （物理滴度單位）

 

       檢測(cè)方法：定量PCR檢測(cè)干擾后細(xì)胞基因組中外源DNA拷貝數(shù)。

 

       實(shí)驗(yàn)原理：慢病毒介導(dǎo)外源基因以逆轉(zhuǎn)錄方式整合進(jìn)目的細(xì)胞基因組。

 

 

       MOI（multiplicity of infection）：感染復(fù)數(shù)或者復(fù)感染指數(shù)。指感染時(shí)病毒和細(xì)胞數(shù)量的比值。在實(shí)驗(yàn)中也將某個(gè)細(xì)胞達(dá)到 80%感染時(shí)所需的MOI 值定義為這個(gè)細(xì)胞的MOI值。加的病毒量(μl)=細(xì)胞數(shù)×MOI/滴度(…/ml) ×1000。

 

       慢病毒載體的優(yōu)勢(shì)：

 

  （1）表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)：慢病毒可將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組上，實(shí)現(xiàn)基因長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的表達(dá)，不隨細(xì)胞分裂傳代而丟失，是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的首選，常用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

 

   （2）安全性高：未發(fā)現(xiàn)致病性，慢病毒載體改造T細(xì)胞用于CAR-T細(xì)胞治療。

 

    （3）免疫原性低：直接注射活體組織不易造成免疫反應(yīng)，適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

 

       應(yīng)用：

 

       1.基因治療

       2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

       3.基因敲除

       4.藥物研究

       5.慢病毒載體能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型原代細(xì)胞和大部分細(xì)胞系。

       6.慢病毒的感染具有整合特性，能夠?qū)⑼庠椿�因有效地整合到宿主染色體上，因而可以達(dá)到持       久性表達(dá)，從而構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，用于基因的細(xì)胞功能研究。

       7.快速建立生產(chǎn)目的蛋白的細(xì)胞系，非常有前途的真核表達(dá)方法。

 

       說到這里，大家是不是對(duì)慢病毒載體有了一點(diǎn)了解呢？接下來小編給大家推薦一些Genecopoeia有關(guān)慢病毒方面的產(chǎn)品：

 

     （1）首先是關(guān)于慢病毒載體構(gòu)建方面的產(chǎn)品：

 

       ORF表達(dá)克隆，shRNA克隆，miRNA前體表達(dá)克隆，miRNA inhibitor克隆，啟動(dòng)子報(bào)告克隆，CRISPR-Cas9相關(guān)克隆均可構(gòu)建喲，全方面滿足大家的需求。

 

       1.ORF表達(dá)克隆產(chǎn)品

 

慢病毒貨號(hào)	描述	滴度	體積及規(guī)格	慢病毒總量
LPP-貨號(hào)-載體-100	ORF/Promoter/lncRNA 慢病毒	ORF： ≥ 10^8 TU/ml * Promoter：N/A	100ul（50ul× 2管)	1×10^7 TU
LPP-貨號(hào)-載體-400			400ul（50ul× 8管)	4×10^7 TU
LPP-貨號(hào)-載體-A00			1000ul（50ul× 20管)	1×10^8 TU
LPP-貨號(hào)-載體-A05			大包裝 5 ml (默認(rèn)200ul× 25管)	5×10^8 TU
LPP-貨號(hào)-載體-A10			大包裝 10 ml (默認(rèn)200ul× 50管)	1×10^9 TU

 

       2.shRNA克隆產(chǎn)品

 

慢病毒貨號(hào)	描述	滴度	體積及規(guī)格	慢病毒總量
LPP-貨號(hào)-載體-050	shRNA慢病毒	≥ 2×10^8 TU/ml	單條50ul（50ul× 1管)      一套3條 單條50ul（50ul× 1管)	1×10^7 TU
LPP-貨號(hào)-載體-200			單條200ul（50ul×4管) 一套3條 每條200ul（50ul×4管) *3	4×10^7 TU
LPP-貨號(hào)-載體-500			單條500ul(50ul×10管) 一套3條 每條500ul(50ul× 10管) *3	1×10^8 TU
LPP-貨號(hào)-載體-A00			單條1000ul（50ul×20管) 一套3條 單條1000ul（50ul×20管)*3	2×10^8 TU
LPP-貨號(hào)-載體-A10			5 ml (默認(rèn)200ul× 25管)	2×10^9 TU

       3.miRNA克隆產(chǎn)品
 

慢病毒貨號(hào)	描述	滴度	體積及規(guī)格	慢病毒總量
LPP-貨號(hào)-載體-050	miRNA/inhibitor 慢病毒	≥ 2×10^8 TU/ml	50ul（50ul× 1管)	1×10^7 TU
LPP-貨號(hào)-載體-200			200ul（50ul× 4管)	4×10^7 TU
LPP-貨號(hào)-載體-500			500ul(50ul× 10管)	1×10^8 TU
LPP-貨號(hào)-載體-A00			1000ul（50ul× 20管)	2×10^8 TU
LPP-貨號(hào)-載體-A10			5 ml (默認(rèn)200ul× 25管)	2×10^9 TU
LPP-貨號(hào)-載體-025	對(duì)照慢病毒	≥ 10^8 TU/ml	25ul （25ul× 1管）	0.25×10^7 TU
LPP-貨號(hào)-載體-100			100ul （25ul× 4管）	1×10^7 TU
LPP-貨號(hào)-載體-200			200ul （25ul× 8管）	2×10^7 TU
LPP-貨號(hào)-載體-400			400ul （25ul× 16管）	4×10^7 TU
LPP-貨號(hào)-載體-A00			1000ul （100ul × 10管）	1×10^8 TU

 

       4.Cas 9 和sgRNA克隆產(chǎn)品
 

慢病毒貨號(hào)	描述	滴度	體積及規(guī)格	慢病毒總量
LPP-CP-LvC9NU-載體-100	Cas9 慢病毒	1x10^6 - 1x10^7 TU/ml	100 µl (50ul×2管)	> 1x10^6 TU
LPP-CP-LvC9NU-載體-400			400 ul(50ul×8管)	> 4x10^6 TU
LPPHCP[gene]L03-1-200 LPPHCP[gene]L03-3-200	sgRNA慢病毒	≥ 10^8 TU/ml	單條200ul（50ul×4管) 一套3條 每條200ul（50ul×4管)*3	單條： 2×(10^6-10^7)TU 一套3條 每條： 2×(10^6-10^7)TU
LPPCCPCTR01L03-100	sgRNA對(duì)照慢病毒	≥ 10^8 TU/ml	100ul（25ul× 4管)	1×10^7 TU
LPPCCPCTR01L03-400			400ul（25ul× 16管)	4×10^7 TU

 

      （2）慢病毒包裝服務(wù)產(chǎn)品（慢病毒顆粒，病毒濃縮，包裝細(xì)胞系等）

 

產(chǎn)品	描述	用戶手冊(cè)/數(shù)據(jù)表
LT001	基于HIV骨架的慢病毒顆粒包裝試劑 (20 reactions)	HIV-based lentiviral packaging plasmids, eGFP control clone and EndoFectin Lenti Transfection Reagent
LT002	基于HIV骨架的慢病毒顆粒包裝試劑 (40 reactions)	HIV-based lentiviral packaging plasmids, eGFP control clone and EndoFectin Lenti Transfection Reagent
LT003	基于HIV骨架的慢病毒顆粒包裝試劑 (5 reactions)	HIV-based lentiviral packaging plasmids, eGFP control clone and EndoFectin Lenti Transfection Reagent
LT005	基于qRT-PCR技術(shù)的HIV骨架慢病毒顆粒滴度檢測(cè)試劑 （20次RT反應(yīng) +50次PCR反應(yīng)）	qRT-PCR based titration to determine the copy numbers of HIV lentiviral particles.
LT006	基于qRT-PCR技術(shù)的HIV骨架慢病毒顆粒滴度檢測(cè)試劑 （40次RT反應(yīng) +100次PCR反應(yīng)）	qRT-PCR based lentiviral titration to determine the copy numbers of HIV lentiviral particles.
LT007	慢病毒濃縮試劑盒（50 ml）	Quick and simple concentration of lentiviral particles
LT008	293Ta慢病毒顆粒包裝細(xì)胞系 (1.5 x 106 cells)	293Ta Lentiviral packaging cell line
MP002	MycoGuard™ Mycoplasma Bioluminescent Detection Kit(10 次反應(yīng))	應(yīng)用生物熒光，可快速、簡(jiǎn)單檢測(cè)出細(xì)胞培養(yǎng)過程中存在的支原體。
MP003	MycoGuard™ Mycoplasma Bioluminescent Detection Kit(50 次反應(yīng))	應(yīng)用生物熒光，可快速、簡(jiǎn)單檢測(cè)出細(xì)胞培養(yǎng)過程中存在的支原體。
MP004	MycoGuard™ Mycoplasma PCR Detection Kit 2.0(50 次反應(yīng))	利用PCR技術(shù)快速檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)過程中存在的支原體。

 

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