熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET肽和寡核苷酸熒光標記的應用

       前情回顧：

 

       生物素標記工具

 

       鏈霉親和素標工具

 

       熒光蛋白標記工具

 

       熒光染料標記的肽和寡核苷酸是生化和細胞研究中的重要工具，目前熒光肽和寡核苷酸已廣泛用于所有主要類型的熒光成像中，包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），這些標記的生物分子被廣泛用于基于分子信標和其他技術的傳染病診斷。FRET肽和寡核苷酸也已通過熒光相關細胞分選（FACS）用于細胞分析，用于體內(nèi)或體外的研究和診斷目的。

 

       肽和蛋白質(zhì)分子量計算器：

 

       為了幫助您計算寡肽和蛋白的分子量，請使用我們的在線計算器，肽和蛋白質(zhì)分子量計算器：https://www.aatbio.com/tools/calculate-peptide-and-protein-molecular-weight-mw

 

       用于熒光標記染料

 

       根據(jù)肽/寡核苷酸的序列，可以通過共價鍵將熒光染料在特定點連接至肽/寡核苷酸。染料和肽/寡核苷酸之間的連接是共價鍵，在大多數(shù)生物學條件下較穩(wěn)定且不會被破壞。在某些情況下，在染料和肽/寡核苷酸之間引入功能性接頭來使肽/寡核苷酸生物活性改變最小，對于所有的肽/寡核苷酸標記，染料都必須連接在確定的位置。通常，優(yōu)選的熒光標記應具有高的熒光量子產(chǎn)率并保留未標記生物分子的生物學活性。

 

v我們?yōu)榇蠹姨峁┝硕喾N類型熒光標記染料，便于染料與用于生物學研究的肽/寡核苷酸的結合，這些熒光染料包括香豆素，熒光素，羅丹明和花青素，其中，我們的Tide Fluor™，California Red™，SunRed™和Helix Fluor™染料經(jīng)過優(yōu)化，可標記肽和寡核苷酸。

 

       花青素染料家族和其他經(jīng)典染料

 

 

       圖1.將 HeLa細胞與tubulin抗體孵育，然后與Cy5®山羊抗小鼠IgG偶聯(lián)物（紅色）一起孵育。細胞核用Hoechst 33342（藍色，Cat# 17530）染色。

 

       盡管現(xiàn)代染料（例如iFluor™染料）通常用于更具挑戰(zhàn)性的生物學應用，但經(jīng)典的熒光標記染料有時因其較低的成本而非常適用于某些要求不高的應用。在經(jīng)典的標記染料中，cyanines是最受歡迎的選擇之一，其他染料包括FAM，TAMRA和TexasRed®，也都可以用于偶聯(lián)肽和寡核苷酸。

 

       花青素染料家族和其他用于熒光標記染料的經(jīng)典染料：

 

花青染料	激光	Ex / Em（nm）	濾光片組	消光系數(shù)（ε）	量子產(chǎn)率（Φ）
Cy3	532 nm	554/568 nm	Cy3 / TRITC	150,000	0.15
Cy5	633-647 nm	650/669 nm	Cy5	250,000	0.27
Cy7	730 nm	754/778 nm	Cy7	250,000	0.3

 

Tide Fluor™系列染料

 

Tide Fluor™染料經(jīng)過優(yōu)化，可作為開發(fā)FRET寡核苷酸和肽的基礎，我們的Tide Fluor™染料比香豆素，熒光素，羅丹明和花青素等經(jīng)典標記染料具有更強的熒光，更高的光穩(wěn)定性。

 

 

       用于熒光標記的Tide Fluor™系列染料：
 

貼標染料	Ex（nm）	Em（nm）	消光系數(shù)（ε）	量子產(chǎn)率	CF260	CF280
Tide Fluor™1	345	442	20000	0.95	0.246	0.187
Tide Fluor™2WS	502	525	75000	0.9	0.211	0.091
Tide Fluor™2	500	527	75000	0.9	0.288	0.201
Tide Fluor™3WS	555	565	150000	0.105	0.079	0.079
Tide Fluor™3	555	584	85000	0.85	0.331	0.201
Tide Fluor™4	590	618	90000	0.91	0.489	0.436
Tide Fluor™5WS	649	664	250000	0.25	0.023	0.027
Tide Fluor™6WS	676	695	220000	0.18	0.111	0.009
Tide Fluor™7WS	749	775	275000	0.12	0.009	0.049
Tide Fluor™8WS	775	807	250000	0.08	0.103	0.109

 

       CF260是染料在260 nm處的校正因子，用于消除染料對260 nm處的吸光度的影響（用于寡核苷酸和核酸標記）

 

       CF280是染料280 nm處的校正因子，用于消除染料對280 nm處的吸光度的影響（用于肽和蛋白質(zhì)標記）

 

       其他系列染料

 

       我們的California Red™，Sunnyvale Red™和Helix Fluor™染料非常適合對寡核苷酸和肽進行強大，高效的標記。這些系列具有改進的性能和亮度，仍然與傳統(tǒng)的熒光標記染料（例如FAM，TET，VIC，JOE，NED，TAMRA和ROX）檢測平臺兼容。

 

       其他熒光標記系列染料：

 

貨號	產(chǎn)品名稱	Ex（nm）	Em（nm）	規(guī)格
250	Helix Fluor™545，琥珀酰亞胺酯	525	545	1mg
251	Helix Fluor™575，琥珀酰亞胺酯	546	575	1mg
394	Sunnyvale Red™SE *替代6-ROX *	576	605	5mg
473	California Red™ SE	583	603	5mg
479	California Red™ SE	583	603	1mg

 

       不用于熒光標記的染料

 

       蛋白酶參與許多生理過程， 蛋白酶的檢測和特定蛋白酶抑制劑的篩選對于發(fā)現(xiàn)用于治療和管理蛋白酶相關疾病的潛在藥物至關重要，各種供體和受體分子（熒光的或非熒光的）附著在肽/蛋白質(zhì)上（形成內(nèi)部淬滅的結合物），并根據(jù)氨基酸序列用于檢測蛋白酶。精心選擇供體和受體分子，使受體的激發(fā)波長與供體發(fā)射波長重疊，從而確保熒光通過共振能量轉(zhuǎn)移而淬滅，底物的酶水解導致供體和受體分子的空間分離，從而恢復供體熒光。

 

       FRET原理

 

       熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是一種物理現(xiàn)象，在生物醫(yī)學研究和藥物發(fā)現(xiàn)中已經(jīng)越來越流行。FRET是能量從供體分子（donor）到受體分子（acceptor）的無熱量傳輸。供體分子是最初吸收能量的熒光基團，而受體是隨后轉(zhuǎn)移能量的熒光基團，這種共振相互作用發(fā)生在大于原子間的距離上，而沒有轉(zhuǎn)化為熱能并且沒有任何分子碰撞。能量轉(zhuǎn)移導致供體的熒光強度和激發(fā)態(tài)壽命的減少，以及受體的發(fā)射強度的增加。以發(fā)生FRET的方式相互作用的一對分子通常稱為供體/受體對。由于它對距離敏感，F(xiàn)RET被用于觀察分子間相互作用。

 

       圖2. 從供體到受體分子的FRET過程圖。水平線代表每個分子的離散電子能級。能級被標記為單峰態(tài)（S）或三重態(tài)（T），其下標分別為0，1或2（分別代表基態(tài)，第一激發(fā)態(tài)或第二激發(fā)態(tài)）。分子的電子通常處于基態(tài)S0。電子可以通過許多過程被激發(fā)到更高的能級，包括光吸收和化學反應。

 

       盡管有很多影響FRET的因素，但要使FRET發(fā)生需要滿足的主要條件相對較少：

 

       供體和受體分子必須彼此接近（通常為10-100Å）

       受體的激發(fā)光譜必須與供體的發(fā)射光譜重疊。它們重疊的程度稱為光譜重疊積分（J）

       供體和受體過渡偶極的方向必須近似平行

 

       假設供體受體對是相匹配的，發(fā)生FRET所必需的最關鍵元素是供體受體對之間的緊密接近。Förster證明了過程（E）的效率取決于供體與受體之間距離的六次方的倒數(shù)，如以下等式所示：

 

E = R o 6 /（R o 6 + r 6）

 

       其中Ro是能量傳遞一半時的Förster距離，r是供體與受體之間的實際距離。Ro的大小取決于體與受體的光譜性質(zhì)。Förster距離在20到90Å之間時，對研究生物大分子最有用。

 

       Tide Quencher™系列

 

       盡管DABCYL已被用于開發(fā)各種FRET應用，但對于較長波長的染料（例如熒光素，羅丹明和花青素）的淬滅效率較低，限制了其在敏感的熒光FRET探針開發(fā)中的應用。另外，DABCYL的吸收光譜對環(huán)境敏感。我們已開發(fā)出耐用的Tide Quencher™受體染料，用于研發(fā)更長波長的FRET探針，Tide Quencher™染料是消除經(jīng)典淬滅劑限制的絕佳選擇。

 

 

       Tide Quencher™染料的主要優(yōu)點：

 

       探索其他淬滅劑可能無法實現(xiàn)的FRET潛力

       多種反應形式便于自我構建所需的FRET生物分子

       與您所需的熒光供體完全匹配

       性價比高

 

       Tide Quencher™系列產(chǎn)品：

 

淬滅劑	激發(fā)（nm）	消光系數(shù)（ε）	CF260	CF280
Tide Quencher™1	488	20,000	0.147	0.194
Tide Quencher™2	512	21,000	0.100	0.120
Tide Quencher™2WS	515	21,000	0.100	0.120
Tide Quencher™3	576	22,000	0.085	0.091
Tide Quencher™3WS	576	90,000	0.186	0.205
Tide Quencher™4	604	23,000	0.146	0.183
Tide Quencher™4WS	604	90,000	0.149	0.136
Tide Quencher™5	661	24,000	0.170	0.082
Tide Quencher™5WS	661	130,000	0.072	0.082
Tide Quencher™6WS	691	130,000	0.120	0.102

 

       CF260是染料在260 nm處的校正因子，用于消除染料對260 nm處的吸光度的影響（用于寡核苷酸和核酸標記）

 

       CF280是染料280 nm處的校正因子，用于消除染料對280 nm處的吸光度的影響（用于肽和蛋白質(zhì)標記）

 

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