T細(xì)胞尼龍毛柱分離法的操作使用

在研究體內(nèi)及體外的免疫系統(tǒng)時(shí)，分離淋巴細(xì)胞群是一個(gè)關(guān)鍵步驟。因?yàn)楝F(xiàn)在市場(chǎng)上并沒有針對(duì)B細(xì)胞的特異性抗血清，所以分離淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞并不是十分方便。

T細(xì)胞尼龍毛分離法利用了尼龍毛對(duì)B細(xì)胞的親和力，從而使T細(xì)胞在沒有嚴(yán)重?fù)p傷的情況下達(dá)到的足夠的純度。因?yàn)檫@個(gè)方法不像流式和磁珠費(fèi)用昂貴，而且操作簡(jiǎn)便，所需要的條件也不高，是一種非常實(shí)用的方法。 　

　(在此我向各位解釋一下，現(xiàn)在分離T細(xì)胞的方法主要是三種，流式，磁珠法，尼龍毛法。與前兩種方法相比，尼龍毛法的優(yōu)勢(shì)在于無(wú)需特定的設(shè)備儀器，一般的實(shí)驗(yàn)室均有條件操作；價(jià)格相對(duì)低廉；可以進(jìn)行大量樣本操作。) 　

　首先要指出的是實(shí)驗(yàn)中所使用的是分離T細(xì)胞專用的尼龍毛(Nylon Fiber)，不是化工上的尼龍纖維，曾經(jīng)有人問過我這種問題，如果你買錯(cuò)了，可是做不出來(lái)的！

其次，現(xiàn)在市面上的尼龍毛也是良雋不齊，也有同仁反應(yīng)買到的尼龍毛加入緩沖液以后成了一團(tuán)糨糊，根本沒法使用，這個(gè)問題就要靠各位的慧眼了。 　　
現(xiàn)在市面上有尼龍毛填料，也已經(jīng)有了商品化的尼龍毛柱子，這兩者的區(qū)別主要是以下兩點(diǎn)： 　　

1. 商品化的柱子的填料量是已經(jīng)定好的，有一個(gè)確定的上樣量范圍。而自己買填料裝柱可以控制填料量，也就是可以控制上樣量，這對(duì)于樣本量非常少，或是樣本量非常大的實(shí)驗(yàn)需求非常合適。 　

2. 商品化的柱子已經(jīng)經(jīng)過了無(wú)菌處理(一般是輻射滅菌)，而自己裝柱當(dāng)然就要自己滅菌了。 　　

3. 商品化的柱子在實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性上有著絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。自己裝的柱子在填料的處理和裝柱的松緊等方面不容易控制，差異性的控制就看你的實(shí)驗(yàn)技巧了。 　　

操作方法： 　　
1.秤取1.5g尼龍毛裝入20-30ml玻璃或一次性注射器內(nèi)(要可以滅菌的)，填料的體積控制在15毫升左右(注射器上有標(biāo)記，所以還是比較好控制的)，因?yàn)槟猃埫�的松緊關(guān)系到T細(xì)胞的回收率，

所以要特別注意。注射器下端配接5厘米左右長(zhǎng)的帶有彈簧夾的橡皮管。 　

2. 加入大量的PBS平衡柱子后，用鋁箔包裹，并置于適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)，高壓滅菌15分鐘。 （商品化尼龍毛柱以上步驟可以省略，經(jīng)過無(wú)菌PBS平衡后直接進(jìn)行下列步驟。） 　

3. 滅菌的尼龍毛柱垂直固定后放于超凈臺(tái)內(nèi)，頂部以鋁箔覆蓋，避免污染。 　

4. 橡皮管，彈簧夾用wu水酒精消毒后接注射器下端，打開彈簧夾調(diào)節(jié)流速在大約3-4ml/min。 　　

5.首先，加入3-4倍柱體的無(wú)血培養(yǎng)基平衡；隨后，之后加入相同體積的含有血清的培養(yǎng)基平衡（上述培養(yǎng)基都要預(yù)熱），最后等培養(yǎng)基頁(yè)面接近柱填料頁(yè)面時(shí)，關(guān)閉彈簧夾。 　

6. 樣本細(xì)胞懸浮液濃度控制在5×108cells/ml的，上樣量一般是1/3-1/5柱體積(商品化的柱子一般都有推薦上樣量)。樣品加入之后，再加入少量培養(yǎng)液，然后關(guān)閉彈簧夾。 　

7. 柱上覆蓋鋁箔，移置于消毒過的容器中，37℃孵育1小時(shí)。此過程中柱子必須要保持垂直狀態(tài)。 　　

8. 從培養(yǎng)箱中拿出柱子，置于超凈臺(tái)內(nèi)，除去鋁箔。接上按照4.中的方法消毒的彈簧夾和橡皮管，加入適當(dāng)體積經(jīng)37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基，打開彈簧夾控制流速在3-4 mL/min，流出約5ml之后，流出的培養(yǎng)液基變得不透明，此時(shí)其中含有T細(xì)胞，收集這一部分培養(yǎng)基。

9. 基本上何時(shí)結(jié)束收集取決于流出液體中細(xì)胞的濃度，實(shí)際上，收集的量達(dá)到一個(gè)柱體積時(shí)就可以停止收集，因?yàn)榧词故占�更多的量，回收率幾乎不�?huì)增加。 　

10 。參考數(shù)據(jù)： 　　樣本：小鼠脾臟（T細(xì)胞含量在30-40%，B細(xì)胞含量在55-60%） 　　細(xì)胞回收率：13-25% 　　B細(xì)胞污染率：小于15% 　　

　樣本：大鼠脾臟（T細(xì)胞含量在30-35%，B細(xì)胞含量在55-65%） 　　細(xì)胞回收率：大于25% 　　B細(xì)胞污染率：小于15% 　　 　　

樣本：人或兔外周血 　　細(xì)胞回收率 : 20-30% (人)；25-35% (兔) 　　B細(xì)胞污染率：小于5% (人、兔) 　　 　

�。ㄗⅲ┦占�粘附于尼龍毛上的細(xì)胞時(shí)，將T細(xì)胞收集完畢后的尼龍毛在無(wú)菌操作的狀態(tài)下取出，轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦�，用鑷子小心的將尼龍毛松開，粘附的細(xì)胞可以洗到培養(yǎng)基中。

或者將注射器芯插入注射器內(nèi)，通過壓力使的粘附的細(xì)胞隨著液體流出。