強大的基因組編輯工具-Crisp/cas9

 

貨號	產(chǎn)品	篩選標記	報告基因
CCPCTR01-CG02	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02.	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02.	N/A
CCPCTR01-CG04	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04
CCPCTR01-CG07	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07
CCPCTR01-CG08	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 with mCherry
CCPCTR01-LvSG03	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03	mCherry
CCPCTR01-SG01	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01	N/A

 

（2）還有sgRNA亂序?qū)φ章�病毒顆粒

 

貨號	產(chǎn)品	描述	啟動子	篩選標記	sgRNA
LPP-CCPCTR01-LvSG03-100	sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒（25 µL×4管）	108 TU/ml sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆，轉(zhuǎn)導(dǎo)級	EF1a	Puromycin	CCPCTR01-LvSG03
LPP-CCPCTR01-LvSG03-400	sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒（100µL，25 µL×16管）	108 TU/ml sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆，轉(zhuǎn)導(dǎo)級	EF1a	Puromycin	CCPCTR01-LvSG03

 

圖3. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T細胞中的HUWEI基因。（A）HUWEI-sgRNA與基因組PCR引物設(shè)計；（B）在6孔板中，HUWEI-sgRNA/Cas9克隆與sgRNA/Cas9對照克�。ㄓ镜�2）轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。轉(zhuǎn)染40h后收集細胞，提取基因組DNA并用HUWE特異的PCR引物進行PCR擴增，凝膠純化PCR產(chǎn)物，將純化后的產(chǎn)物與緩沖液混勻，經(jīng)變性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI經(jīng)PCR后的產(chǎn)物片段長度應(yīng)為520bp，T7 ENI剪切后的產(chǎn)物應(yīng)分別為330bp和190bp。

 

圖4. CRISPR-Cas9多重靶向編輯多個基因。實驗組（1-4泳道）為Cas9表達克隆及分別表達靶向p53, HUWE1, NCL3 和 GFP基因的sgRNA克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293t GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞。對照組（5-8泳道）為Cas9表達克隆質(zhì)及隨機sgRNA表達克隆的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293t GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞。通過T7核酸內(nèi)切酶檢測分析基因組DNA各個靶點上同時存在的插入缺失。*號標記的條帶顯示Cas9核酸酶及分別靶向多個靶點的sgRNA都在目標靶點上有效地誘發(fā)了插入缺失突變（1-4道）。PCR產(chǎn)物條帶及T7核酸內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物條帶大小：GFP: 720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切); HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp (酶切).

 

（3）sgRNA 文庫

 

 

圖5. A：混合文庫篩選。對感染了sgRNA混合文庫的細胞株進行篩選，獲取具備目的表型的陽性細胞株進行Sanger測序識別對應(yīng)的sgRNA，或通過深度測序搜索比例過高或過低的sgRNA。B：使用 sgRNAs 文庫array（獨立克隆文庫）進行基因敲除篩選。各板孔里的細胞株分別感染不同的sgRNA慢病毒顆粒，并篩選具備目的表型的陽性細胞株。如此無需測序即可獲知與目的表型相關(guān)的sgRNA。

 

人類 sgRNA 文庫相關(guān)產(chǎn)品

 

貨號	文庫	sgRNA 數(shù)目	基因數(shù)目	管數(shù)	載體
L01-LS03	Innate kinases & ubiquitin ligases	475	239	4 管，每管 118-119 個 sgRNA	pCRISPR-LvSG03
L02-LS03	Nuclear hormone receptors	236	118	2 管，每管118 個 sgRNA	pCRISPR-LvSG03
L03-LS03	Tumor metastasis genes	114	57	2 管，每管 57 個 sgRNA	pCRISPR-LvSG03
L04-LS03	Oncogenes	576	288	4 管，每管 144 個 sgRNA	pCRISPR-LvSG03
L05-LS03	Tumor suppressor genes	462	231	4 管，每管 115-116 個 sgRNA	pCRISPR-LvSG03
L06-LS03	Protein kinases	1316	658	10 管，每管 130-131 個 sgRNAs	pCRISPR-LvSG03
L07-LS03	Key genes in 50 pathways	278	139	2 管，每管 139 個sgRNA	pCRISPR-LvSG03

 

2.Cas9系列產(chǎn)品

 

（1）Cas9表達克隆產(chǎn)品

 

貨號	產(chǎn)品	啟動子	報告基因
Cas9核酸酶表達克隆
CP-C9NU-01	Cas9核酸酶表達克隆	CMV	mCherry / Neomycin
Cas9核酸酶慢病毒表達克隆
CP-LvC9NU-01	Cas9核酸酶慢病毒表達克隆	CMV	Neomycin
CP-LvC9NU-02	Cas9核酸酶慢病毒表達克隆	CMV	eGFP / Neomycin
CP-LvC9NU-08	Cas9核酸酶慢病毒表達克隆	EF1a	Puromycin
CP-LvC9NU-09	Cas9核酸酶慢病毒表達克隆	EF1a	eGFP / Neomycin
CP-LvC9NU-10	Cas9核酸酶慢病毒表達克隆	EF1a	eGFP / Hygromycin
Cas9 D10A 切口酶表達克隆
CP-C9NI-01	Cas9 D10A 切口酶表達克隆	CBh	N / A
CP-C9NI-02	Cas9 D10A 切口酶表達克隆	CMV	mCherry / Neomycin

 

（2）慢病毒顆粒類產(chǎn)品

 

貨號	產(chǎn)品	描述	啟動子	報告基因
LPP-CP-LvC9NU-01-100	Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒	1×10^6 – 1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)級，100 µL.	CMV	Neomycin
LPP-CP-LvC9NU-02-100	Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒	1×10^6 – 1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)級，100 µL.	CMV	eGFP/Neomycin
LPP-CP-LvC9NU-10-400	Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒	不低于1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)級，400 µL.	EF1α	eGFP/Hygromycin
LPP-CP-LvC9NU-08-100	Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒	不低于1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)級，100 µL.	EF1α	Puromycin

 

（3）GeneHero™ Cas9 穩(wěn)定表達細胞系

 

新貨號	產(chǎn)品	細胞系	Cas9 整合位點	產(chǎn)品規(guī)格
SL501	穩(wěn)定表達 Cas9 核酸酶基因的人類 H1299 單克隆細胞系	H1299	AAVS1	1管，每管細胞數(shù)2×106
SL502	穩(wěn)定表達 Cas9 核酸酶基因的人類 HEK293T 單克隆細胞系	HEK293T	AAVS1	1管，每管細胞數(shù)2×106
SL503	穩(wěn)定表達 Cas9 核酸酶基因的 人類 HeLa 單克隆細胞系	HeLa	AAVS1	1管，每管細胞數(shù)2×106
SL520	穩(wěn)定表達 Cas9 核酸酶基因的人類AGS單克隆細胞系	AGS	隨機整合	1管，每管細胞數(shù)2×106
SL522	穩(wěn)定表達 Cas9 核酸酶基因的人類SNU475單克隆細胞系	SNU475	隨機整合	1管，每管細胞數(shù)2×106

 

(4）GeneHero™ Cas9蛋白類產(chǎn)品

 

貨號	規(guī)格	產(chǎn)品
GE001	25μg	重組Cas9蛋白含NLS
GE002	100μg	重組Cas9蛋白含NLS
GE003	25μg	重組Cas9蛋白含NLS和C-terminal 6x His-tag
GE004	100μg	重組Cas9蛋白含NLS和C-terminal 6x His-tag

 

 

圖6. 使用HUWE DNA片段作為切割模板。針對HUWE基因設(shè)計3個sgRNA，分別與Cas9蛋白孵育后進行下一步切割實驗。紅點標注為切割后的DNA條帶，Ct為未切割的HUWE DNA片段

 

 

圖7. 使用HUWE DNA片段作為切割模板。sgRNA與Cas9蛋白孵育后進行切割實驗。GeneHero™ Cas9蛋白（3-5列）與IDT Alt-R® Cas9蛋白（6-7列）分別進行250ng，100ng和50ng稀釋反應(yīng)。紅箭頭標注為切割后的DNA條帶，1列反應(yīng)中只有Cas9，2列反應(yīng)中只有sgRNA。

 

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