數字PCR技術在DNA定量精準等領域的應用

數字PCR

先進的數字PCR技術實現了樣品中的單分子核酸擴增，從而使的DNA定量的精準度提高到了全新水平。Philip與Stilla Technologies的首席執(zhí)行官兼聯(lián)合創(chuàng)始人Rémi Dangla進行了交流，討論了數字PCR技術領域的進展和挑戰(zhàn)。

Stilla Technologies公司總部位于法國巴黎，成立于2013年，生產和銷售高精準度的DNA定量和檢測的數字PCR系統(tǒng)。

“當我創(chuàng)立公司時，從未做過PCR，”Dangla說。 “但我了解了數字PCR技術之后，馬上就被這個設計巧妙的技術所吸引。”

與之前的PCR技術相比，數字PCR是可以顯著提高DNA定量的精準度的一種新技術。

“數字PCR技術為PCR技術在檢測稀有突變或低濃度靶標基因方面的應用，賦予了無與倫比的數據可靠性”Dangla說。

數字PCR反應，不是傳統(tǒng)式的混好PCR mix后直接擴增，而是將樣品被分散到數萬個微小的液滴后，進行PCR反應。科學家們設計特異性的探針，只識別與序列相對應的靶標基因，產生熒光信號，數字PCR系統(tǒng)自動數出含有陽性信號的微滴。

“這樣的技術可以從100,000個野生型DNA分子中檢測出一個突變分子，甚至是突變體只發(fā)生單堿基改變，也能被檢測到。在使用之前的PCR技術進行這種實驗分析時，得到的結果是錯誤的。”Dangla說。

實際上很早就有人提出了數字PCR的想法，“文獻可追溯到90年代初”Dangla說。

當時的困難在于如何實現同時分析這么小的體積、且數量這么多的微滴。Dangla找到了解決這個困難的方法，將微流控技術和芯片技術結合，最大程度的簡化了微滴的生成和分析。

Dangla認為數字PCR技術最具潛力的應用之一是只需少量血液樣品即可進行癌癥診斷，也就是液體活檢技術。

“在嘗試使用血液樣本，進行血液樣本中的ctDNA檢測時，就類似大海撈針，”他解釋道。 “數字PCR技術是唯一可以檢測血液中的ctDNA分子并獲得可靠結果的解決方案。”

例如，數字PCR特別有助于檢測癌細胞對治療中產生耐藥性的突變，從而指導醫(yī)生用藥，更換治療效果更好的其他藥物。

數字PCR技術的潛在應用方向吸引了許多參與者進入日益增長的數字PCR市場，從2011年到現在增長數百萬歐元。最早是Fluidigm公司，它于2006年發(fā)布了第一款產品，Bio-Rad現在以更低的價格占有最大市場份額。 Stilla Technologies公司的目標是實現市場上最簡單，最快速的數字PCR技術，目前在這一領域已占有重要位置。

但仍然需要克服一些挑戰(zhàn)，其中之一就是定價。 Dangla說數字PCR不可能完全取代前幾代PCR技術。到目前為止，數字PCR價格偏貴，僅被用于更具意義的應用中。

隨著技術的發(fā)展，成本問題即可解決，Dangla認為在精準DNA定量方便有個重要的但是被忽視了就是樣品制備。本質上講，就是數字分析前的DNA提取步驟。

“我們現在知道有關患者的所有信息都存在于含有一些稀有的生物標記物的10mL血液中。 現在的困難不是在分析系統(tǒng)中找到這些生物標記物;  DNA分子在芯片中，那就會被找到，會被檢測到”Dangla說。

“困難在于如何在10mL中提取到DNA分子，并確保在20μL體系中能夠檢測和分析到。 這是一個取樣問題。“

隨著上個月的首次融資活動結束，Stilla正在考慮擴大其數字PCR系統(tǒng)的銷售，并將開展Naica數字PCR系統(tǒng)在臨床的應用，首先將從實現癌癥患者液體活檢樣本的分析開始。

除腫瘤領域的應用外，數字PCR還應用在很多其它領域中，如轉基因檢測，制藥公司的質量控制、伴隨診斷等。隨著數字PCR技術變得越來越精確，和成本的降低，這項DNA定量的新生技術將會越來越廣泛。