徠卡LMD在研究冠狀病毒對細胞NF-κB信號通路和染色質分布的使用
冠狀病毒因為包膜上密布著類似日冕的棘突而得名，屬于冠狀病毒科，正冠狀病毒亞科的冠狀病毒屬。根據(jù)血清學和基因組學特點，該屬名代表了α、β、γ和δ四個屬。目前已知感染人的冠狀病毒包括7種，即α屬的普通冠狀病毒HCoV‑229E和HCoV‑OC43，β屬的HCoV‑NL63、HCoV‑HKU1、嚴重急性呼吸綜合征（SARS）-CoV和中東呼吸綜合征（MERS）-CoV，以及此次導致武漢不明原因肺炎的新型冠狀病毒（2019-nCoV）。其中，HCoV‑HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV可以導致人類肺炎，其他是成人普通感冒的病原，兒童較敏感，可致上呼吸道感染。
早在2008年的《Cell》中，一組來自日本科學家發(fā)表了一篇題為《Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression》的文章，文中表示：他們得到了兩種新型熒光蛋白，其中一種能使得G1期細胞核呈現(xiàn)紅色，而另一種使得S/G2/M期細胞核呈現(xiàn)出綠色，研究人員將這些蛋白稱為熒光泛素化細胞周期標志物（Fucci）。
圖1 Cell封面圖片：處于不同細胞周期的細胞核發(fā)出紅色或綠色熒光
圖2 LMD-切割細胞的典型周期狀態(tài)
圖3 細胞株示意圖
他們分離了表達冠狀病毒N蛋白的細胞，并提取了整個RNA。
圖4 借助免疫熒光和激光顯微切割分離細胞株
Laser microdissection實驗過程：
Leica激光顯微切割系統(tǒng)優(yōu)勢
接著，研究人員通過利用RT-qPCR和微陣列分析發(fā)現(xiàn)，與感染細胞緊鄰的細胞在單細胞水平上表征與存在于相同或不同培養(yǎng)物中的相鄰的未感染細胞相反，感染后的基因表達發(fā)生了變化。并通過HCoV-229E病毒N蛋白的免疫熒光（DMIRE2，DMi8）分析來監(jiān)測HCoV-229E感染并在A549細胞中擴散。
病毒學中熒光顯微鏡可以更好地滿足研究人員的需求。然而，在對動物組織進行研究時，仍有機會進行明場顯微鏡檢查，比如檢查病毒感染后組織的形態(tài)變化等。
此外，在細胞培養(yǎng)實驗室中使用明視野顯微鏡檢查已經(jīng)感染或將會感染的細胞（DM IL，DMi1，PAULA）的健康狀況和生長狀態(tài)。
圖6 極化上皮細胞MDCK的明場圖像
Leica顯微鏡在病毒學中的應用遠不止這些，而這些看似基礎的研究工作恰恰起到了直接作用。另外還有其他用于病毒可視化的技術，例如電子顯微鏡(EM)可以分解病毒顆粒、單分子檢測(TCS SP8 SMD)、熒光壽命成像(FLIM) (STELLARIS 8 FALCON)以及多光子顯微鏡(SP8 DIVE)是適用于病毒學的其他方法，這些今后為您介紹。
參考文獻：
[1] Chin J Prev Med, March 2020, Vol.54, No.3
[2] Nat Rev Microbiol. 2013;11(12):836–48. pmid:24217413
[3] Mol Cell. 2014;53(2):193–208.
[4] Cell, Vol 132, 487-498, 08 February 2008
* Am J Pathol. 1999;154(1):61-6.
早在2008年的《Cell》中，一組來自日本科學家發(fā)表了一篇題為《Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression》的文章，文中表示：他們得到了兩種新型熒光蛋白，其中一種能使得G1期細胞核呈現(xiàn)紅色，而另一種使得S/G2/M期細胞核呈現(xiàn)出綠色，研究人員將這些蛋白稱為熒光泛素化細胞周期標志物（Fucci）。
圖1 Cell封面圖片：處于不同細胞周期的細胞核發(fā)出紅色或綠色熒光
圖2 LMD-切割細胞的典型周期狀態(tài)
利用這一發(fā)現(xiàn)，來自德國吉森大學藥理學的Poppe與他的合作者們研究了冠狀病毒對細胞NF-κB通路和染色質分布的影響。
研究人員首先用HCoV-229E感染A549肺癌細胞模型，然后通過激光顯微切割（LMD6000）結合免疫熒光用于分解（i）被HCoV-229E感染的細胞，（ii）與感染細胞緊鄰的細胞，（iii）距離感染細胞至少150μm的細胞（“遠端細胞”）和（iv）單獨的未感染的細胞。
研究人員首先用HCoV-229E感染A549肺癌細胞模型，然后通過激光顯微切割（LMD6000）結合免疫熒光用于分解（i）被HCoV-229E感染的細胞，（ii）與感染細胞緊鄰的細胞，（iii）距離感染細胞至少150μm的細胞（“遠端細胞”）和（iv）單獨的未感染的細胞。
圖3 細胞株示意圖
他們分離了表達冠狀病毒N蛋白的細胞，并提取了整個RNA。
圖4 借助免疫熒光和激光顯微切割分離細胞株
Laser microdissection實驗過程：
- 細胞接種在加入2μm 青霉素（PEN）的30mm的圓形培養(yǎng)皿中。
- 免疫染色和LMD按照預定方案*進行，并進行如下修改。
- 處理結束時，細胞用Hank's平衡鹽溶液(HBSS)洗滌2次，每次5分鐘，并用2ml乙醇固定5分鐘。
- 在HBSS中洗滌30秒，然后用2ml HBSS /0.1% Saponin加10%驢血清封閉，孵育3分鐘。
- 稀釋1:50的N蛋白抗體或1:400的P(S2)-pol II，在含0.1%皂素的400μm Hank’s BSS中37℃孵育。
- 用Hank’s BSS/0.1%皂素洗滌30秒。
- 用y3抗體(1:50)和Dylight488二抗(1:400)，室溫400μl HBSS/0.1% Saponin。
- 在2 ml HBSS中洗滌3次，每次30秒，然后在2ml DEPC水中洗滌30次，然后在40℃干燥30分鐘。
- 使用Leica LMD6000系統(tǒng)將未感染的細胞和感染的細胞切除并收集在微量離心管中，用熒光顯微鏡檢測。
Leica激光顯微切割系統(tǒng)優(yōu)勢
- 從病理樣本、細胞樣本或涂片中，采用激光切割、分離收集特定染色體，細胞，組織，從而進行精準細胞的下游基因組、轉錄組、蛋白組、或代謝組水平的分析及驗證。
- 可應用于特定的單個染色體、細胞、整個組織區(qū)域，甚至骨骼、牙齒、大腦、植物等的切割分離。專利重力非接觸收集模式（專利號：DE 10057292, EP 1207392, JP 3641454）精準、無污染�？膳鋫渥詣痈咄壳懈罴笆占Ｊ�。操作過程中無需移動樣品，而是通過專利的激光光束任意掃描切割（專利號：EP 1276586、US 7035004、JP 3996773），靈活又精準。重力收集模式又很好地避免了樣品污染。
- 采用獨特的激光設計和易用的動態(tài)軟件，高達5000 Hz脈沖的349nm，干凈、高效的切割目標物邊緣，而目標物體無需接觸激光，不受影響。
- 采用普通的0.2或0.5ml離心管即可收集，耗材成本低。
圖5 LMD切割示意圖
接著，研究人員通過利用RT-qPCR和微陣列分析發(fā)現(xiàn)，與感染細胞緊鄰的細胞在單細胞水平上表征與存在于相同或不同培養(yǎng)物中的相鄰的未感染細胞相反，感染后的基因表達發(fā)生了變化。并通過HCoV-229E病毒N蛋白的免疫熒光（DMIRE2，DMi8）分析來監(jiān)測HCoV-229E感染并在A549細胞中擴散。
病毒學中熒光顯微鏡可以更好地滿足研究人員的需求。然而，在對動物組織進行研究時，仍有機會進行明場顯微鏡檢查，比如檢查病毒感染后組織的形態(tài)變化等。
此外，在細胞培養(yǎng)實驗室中使用明視野顯微鏡檢查已經(jīng)感染或將會感染的細胞（DM IL，DMi1，PAULA）的健康狀況和生長狀態(tài)。
圖6 極化上皮細胞MDCK的明場圖像
Leica顯微鏡在病毒學中的應用遠不止這些，而這些看似基礎的研究工作恰恰起到了直接作用。另外還有其他用于病毒可視化的技術，例如電子顯微鏡(EM)可以分解病毒顆粒、單分子檢測(TCS SP8 SMD)、熒光壽命成像(FLIM) (STELLARIS 8 FALCON)以及多光子顯微鏡(SP8 DIVE)是適用于病毒學的其他方法，這些今后為您介紹。
參考文獻：
[1] Chin J Prev Med, March 2020, Vol.54, No.3
[2] Nat Rev Microbiol. 2013;11(12):836–48. pmid:24217413
[3] Mol Cell. 2014;53(2):193–208.
[4] Cell, Vol 132, 487-498, 08 February 2008
* Am J Pathol. 1999;154(1):61-6.
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