D-螢光素 Protocol 在生物發(fā)光檢測中的應(yīng)用

D-螢光素，螢火蟲螢光素酶的化學(xué)發(fā)光底物，廣泛用于體外生物發(fā)光、體內(nèi)活體成像。螢螢之光，照亮您的科研之路！

 

■ Q: D-螢光素的作用原理

D-螢光素 (D-Luciferin) 是螢火蟲螢光素酶 (Firefly Luciferase) 的化學(xué)發(fā)光底物。在ATP 和螢光素酶存在下，螢光素能夠被氧化發(fā)光 (圖 1) 。當(dāng)螢光素過量時，發(fā)光亮度與螢光素酶濃度呈正相關(guān)。通過螢光素/螢光素酶生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測基因表達(dá)、腫瘤生長、藥物反應(yīng)等。

圖 1. D-螢光素發(fā)光原理

 

■ Q: 游離態(tài)和鹽形式的 D-螢光素，怎么選？

 

目前市面上主要有 3 種 D-螢光素，D-螢光素游離酸 (HY-12591A)、鈉鹽 (HY-12591) 和鉀鹽 (HY-12591B)。D-螢光素鈉鹽、鉀鹽易溶于水，而游離酸形式難溶于水，需要適當(dāng)?shù)膲A中和才能溶于水。配成溶液后，這 3 種形式的 D-螢光素生物活性相當(dāng)。

 

■ Q: 外生物發(fā)光、體內(nèi)活體成像的檢測怎么操作？

 

以 D-螢光素鉀鹽 為例：

1、體外生物發(fā)光檢測 (In vitro bioluminescent assays)

 

1) 將細(xì)胞鋪在 24 孔黑孔板上，鋪板密度為 0.5-2.0×10⁵ 個細(xì)胞/孔，37℃，培養(yǎng)過夜。

 

2) 用超純水配制 15 mg/mL 的 D-螢光素儲存液 (100×)。

注：D-螢光素溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，也可分裝后-20℃ 避光凍存，有效期 1 個月。

 

3) 用預(yù)熱好的細(xì)胞培養(yǎng)基 1: 100 稀釋儲存液，配制終濃度 150 μg/mL 的 D-螢光素工作液 (1×)。

 

4) 去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基直至無殘留。

 

5) 向細(xì)胞內(nèi)添加 1×D-螢光素工作液后，立即進(jìn)行圖像分析。

 

圖 2. MDA-MB-231-Luc2 細(xì)胞生物發(fā)光檢測結(jié)果 ^[1]

(客戶驗證)


2、小鼠活體成像分析 (In vivo analysis in mice)

 

1) 用無菌的 DPBS (no Mg²⁺、Ca²⁺) 配制 15 mg/mL 的 D-螢光素溶液，0.2 μm 濾膜過濾除菌。

 

注：D-螢光素溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，也可分裝后 -20℃ 避光凍存，有效期 1 個月。

 

2) 按 150 mg/kg 劑量和 10 μL/g 注射體積向每支小鼠注射相應(yīng)量的 15 mg/mL D-螢光素溶液。

 

3) 腹腔或靜脈注射 5-15 min 后進(jìn)行活體成像分析。

圖 3. 小鼠活體成像結(jié)果 ^[2]

(客戶驗證)

 

參考文獻(xiàn) 
1. Bondareva, A., et al. The Lysyl Oxidase Inhibitor, β-Aminopropionitrile, Diminishes the Metastatic Colonization Potential of Circulating Breast Cancer Cells. PLoS ONE. 2009; 4(5), e5620.
2. Xiaoxiao Du, et al. Establishment of a novel human cell line retaining the characteristics of the original pancreatic adenocarcinoma, and evaluation of MEK as a therapeutic target. Int J Oncol. 2020 Mar;56(3):761-771.